Stress responses of Listeria monocytogenes to antimicrobial substances from lactic acid bacteria : an explorative study

Abstract

Listeria monocytogenes is a gram-positive bacterium that causes severe and life threatening disease both in humans and animals. Due to the severity of the disease and the fact that the bacterium is responsible for considerable economical loss, L. monocytogenes is of a great concern particularly to the food industry. L. monocytogenes is a common food contaminant and nearly all human L. monocytogenes infections are due to ingestion of contaminated food. Antimicrobial components from lactic acid bacteria may serve as safe and natural food preservatives targeting unwanted microorganisms, including L. monocytogenes. Elucidations of how L. monocytogenes respond to the antimicrobial products are crucial steps to devise a knowledge-based strategy to control this deadly bacterium in food and food-related environments using food grade bacteria. In the present study the responses of L. monocytogenes to the class IIa bacteriocin sakacin P and to acids (acetic, lactic and hydrochloric acid) were explored. Exposure to sakacin P gave spontaneous mutant strains with reduced susceptibility to the bacteriocin. Analysis of large number of the mutant strains using different approaches revealed substantial difference among the strains. The mutant strains displayed difference in (i) the level of resistance to sakacin P, (ii) the stability of the sakacin P resistance phenotype, (iii) growth fitness in various conditions, (iv) biofilm formation ability, (v) virulence potential, (vi) Fourier transform infrared spectroscopy profile, (vii) regulation of the bacteriocin receptor gene, and (viii) global transcriptome profile. Overall, this indicates that the incidence(s) giving rise to the sakacin P resistance involves a complex regulatory gene network possibly mediated by the bacteriocin receptor and have pleiotropic effects on the physiology of the resistant strains. The growth of L. monocytogenes was reduced but not completely inhibited at pH 5 when the growth medium was acidified with hydrochloric acid (HCl), 10 mM acetic acid or 20 mM lactic acid. Acetic acid had the highest antilisterial activity followed by lactic acid and HCl. Stress due to the presence of the acids induced a large number of genes associated with acid defense, virulence, and cross-protection to other types of stresses. Acidulant type dependent responses were also observed. The explorative transcriptome studies confirmed numerous results of previous studies on the response of L. monocytogenes to the class IIa bacteriocins and acid stresses. In addition, it identified a number of putative genes with possible role in the responses under investigation. Altogether, the results presented in this thesis revealed insights contributing to understand the responses of L. monocytogenes to the antimicrobial substances that may be encountered by this bacterium in fermented food and thereby opening new avenues for further studies

Listeria monocytogenes er en gram-positiv bakterie som kan forårsake alvorlig og livstruende sykdom blant både dyr og mennesker. Alvorligshetsgraden av sykdommen og det faktum at bakterien er årsak til stort økonomisk tap, gjør at L. monocytogenes forårsaker stor bekymring, spesielt hos næringsmiddelindustrien. L. monocytogenes forekommer i mange typer mat, og nesten alle humane infeksjoner med L. monocytogenes skyldes inntak av forurenset mat. Antimikrobielle forbindelser fra melkesyrebakterier, som bakteriocin og syrer, kan være trygge og naturlige konserveringsmidler mot uønskete mikroorganismer, inkludert L. monocytogenes. Å avdekke hvordan L. monocytogenes responderer på disse antimikrobielle forbindelsene er viktig for å utvikle en kunnskapsbasert strategi for kontroll av denne bakterien i mat og i matrelaterte omgivelser ved bruk av “food grade” bakterier. I denne studien ble responsen til L. monocytogenes mot klasse IIa bakteriocinet sakacin P, mot lav pH og syrer (eddik- og melkesyre) undersøkt. Eksponering for sakacin P ga spontane mutanter med redusert følsomhet for bakteriocinet. Bred analyse av et stort antall mutanter viste at det var vesentlig forskjell mellom stammene. De muterte stammene hadde forskjeller i (i) resistensnivå mot sakacin P, (ii) stabilitet av resistens fenotype (iii) vekst ved ulike forhold, (iv) evne til biofilmdannelse, (v) virulenspotensial, (vi) Fourier transform infrarød spektroskopiprofil, (vii) regulering av bakteriocinreseptorgenet og (viii) global transkripsjonsprofil. Til sammen indikerer dette at hendelser som medfører økt sakacin P resistens involverer et komplekst genreguleringsnettverk, muligens styrt via bacteriocin reseptoren, som har en mangfoldig påvirkning på fysiologien til de resistente stammene. Vekst av L. monocytogenes ble redusert, men ikke fullstendig hemmet ved pH 5, når vekstmediet var surgjort med saltsyre (HCl), 10 mM eddiksyre eller 20 mM melkesyre. Eddiksyre hadde den største antilisteriaeffekten, etterfulgt av melkesyre og HCl. Stress som følge av nærvær av syrer, induserte et stort antall gener assosiert med syreforsvar, virulens og kryssbeskyttelse mot andre typer stress. Det ble også observert spesifikke responser for de ulike syrene. Transkripsjonsstudier bekreftet flere resultater fra tidligere studier på respons av L. monocytogenes til klasse IIa bakteriociner og syrestress. I tillegg ble det identifisert gener som muligens er involvert i responsene som ble studert. Til sammen gir resultatene presentert i denne avhandlingen innsikt som bidrar ytterligere til å forstå responser til L. monocytogenes mot antimikrobielle forbindelser som denne bakterien kan utsettes for, for eksempel i fermentert mat, noe som kan være interessant å undersøke videre i fremtidige studier.