Molecular mechanisms of pneumococcal fratricide

Abstract

The bacterium Streptococcus pneumoniae is endowed with the ability to take up naked DNA from the surroundings and recombine this DNA into the chromosome. This property, termed competence for natural genetic transformation, plays a fundamental role in the biology and evolution of this pathogen. Induction of the competent state is controlled by a quorum sensing like system: binding of the secreted peptide pheromone CSP to its membrane-embedded receptor ComD activates its cognate cytoplasmic response regulator ComE. Phosphorylated ComE triggers expression of its target genes by binding to a conserved promoter element. Among the ComE regulated genes is comM encoding an immunity protein, and comX which encodes the alternative sigma factor σx. Among the σx regulated genes are genes encoding proteins involved in so-called fratricide (lat: killing of brothers), including the autolysin LytA and the putative murein hydrolase CbpD. LytC encoded by a σ70 dependent gene has also been shown to be important for pneumococcal fratricide. Recent research indicates that fratricide mediates release of DNA from the predated target cells. This liberated DNA can subsequently be taken up and incorporated into the genomes of the attacking cells. Competent pneumococci are able to kill and lyse both non-competent pneumococci and other closely related species. This phenomenon might thus be a central component underlying gene exchange between streptococci, a phenomenon that for example can lead to the spread of antibiotic resistance and vaccine escape. Fratricide might also play a role in the release of virulence factors during host invasion. There is in other words mounting evidence that fratricide is an important phenomenon both from an evolutionary and a public health perspective. The main aim of the work presented here has been to gain a better understanding of pneumococcal fratricide with a focus on the molecular mechanisms underlying the phenomenon. In paper I we show that lysis of target cells is more efficient when LytA and LytC are provided by the target cells than when they are provided by the attacking cells. Whereas LytC was found in copious amounts in the growth medium of both competent and noncompetent cells, LytA could only be detected in whole-cell extracts. Elution of cholinebinding proteins from the cell envelopes of competent cells did not result in release of detectable levels of LytA. A close correlation between cell death and LytA mediated autolysis was also established. Together, these results suggest that LytA might be an intracellular protein that is released upon cell death. CbpD could be detected in the supernatant, but elution with choline showed that most of the protein was attached to the cell envelope. CbpD is normally dependent on LytA and LytC for efficient lysis of target cells, but we found that in the presence of 1.0 mM EDTA, this dependency was lost. In paper II it was established that upon competence-induction in the absence of ComM, the three-component system LiaFSR (Spr0342-HK-RR03) is induced by the concerted action of CbpD, LytA and LytC. The system was also found to protect competent cells against these lysins. Deletion of the response regulator LiaR led to a doubling of lysis upon competence-induction regardless of the presence of ComM, but in cultures harboring a functional ComM, lysis remained very low. In accordance with results from other Firmicutes, the LiaFSR system was found to be induced by the lipid II interacting antimicrobials bacitracin and nisin. Whole-genome microarray analysis of gene expression upon treatment with sub-lethal doses of bacitracin revealed a total of 18 genes, organized in six transcriptional units, to be up-regulated more than 2-fold in the wildtype strain compared to the corresponding liaR mutant. Deletion of two of these genes, spr0810 and pcpC, alone and in combination revealed that these two genes were responsible for most, but not all the protective effect of LiaFSR upon competence induction. In the final part of the study, reported in paper III, zymogram analyses of protein extracts established that CbpD is a murein hydrolase. CbpD consists of an N-terminal CHAP domain followed by two SH3b domains and a C-terminal choline-binding domain. A CbpD fusion protein with the CHAP domain exchanged with green fluorescent protein was found to target the division zone of pneumococci. Deletion studies revealed that this targeting was conferred on the protein by the choline-binding domain. The SH3b domains of CbpD were shown to bind peptidoglycan. Further studies established that both binding-specificities are essential for CbpD to lyse target cells. Finally, transmission electron microscopy revealed that CbpD causes ruptures in the division zone of cells under attack.

Streptococcus pneumoniae kan ta opp DNA frå omgjevnadane og inkorporere dette arvematerialet i sitt eige genom. Denne evna spelar ei fundamental rolle i evolusjonen til denne bakterien. Kompetanse for genetisk transformasjon er kontrollert av eit ”quorum sensing” liknande system: Binding av peptidferomonet CSP til reseptoren ComD aktiverer responsregulatoren ComE. ComE aktiverer transkripsjon av ei fleire gener, blant anna immunitetsproteinet ComM og den alternative sigmafaktoren σx. Blant dei σx kontrollerte genene finn ein gener som kodar for protein involvert i såkalla ”fratricide” (broderdrap), mellom anna CbpD og autolysinet LytA. LytC som er koda av eit σ70-kontrollert gen er óg viktig for fratricide. Nyare forskning indikerer at fratricide medfører frigjering av DNA frå dei predaterte målcellene. Frigjort DNA kan i neste omgang takast opp og integrerast i genoma til angriparcellene. Kompetente pneumokokkar kan drepe og lysere både ikkje-kompetente pneumokokkar og andre nært beslekta artar. Dette fenomenet kan difor vere ein sentral komponent i genutveksling mellom streptokokkar, eit fenomen som mellom anna kan medføre spreiing av antibiotikaresistens. Det er óg mogeleg at fratricide bidreg til frigjering av virulensfaktorar ved invasjon av verten. Det er altså mykje som tyder på at fratricide er eit viktig fenomen både i eit evolusjonært perspektiv og eit folkehelseperspektiv. Hovudmålet med arbeidet har vore å auke kunnskapen om dette fenomenet med eit fokus på dei molekylære mekanismane som ligg bak. I artikkel I syner vi at lysis av målceller er meir effektiv når LytA og LytC vert produsert av målcellene sjølv enn om dei vert produsert av angriparane. LytC vart funne i store mengder i vekstmediet til både kompetente og ikkje-kompetente celler. LytA vart berre detektert i celleekstrakt, i hovudsak i kompetente celler. Eluering av cholin-bindande protein frå celleoverflata medførte ikkje frigjering av målbare mengder LytA. Vidare såg vi at det er ein nær korrelasjon mellom celledaud og LytA-indusert autolyse. Saman tyder desse resultata på at LytA kan vere eit intracellulært protein som vert frigjort og aktivert ved celledaud. CbpD vart funne i vekstmediet under kompetanse, men eluering med cholin indikerte at det meste av proteinet var bunde til celleoverflata. CbpD er normalt avhengig av LytA og LytC for effektiv lysis av målceller, men vi fann at tilsats av 1,0 mM EDTA gjorde CbpD i stand til effektivt å lysere målceller aleine. I artikkel II vart det vist at tre-komponent systemet LiaFSR vert aktivert av CbpD, LytA og LytC ved kompetanse-induksjon i fråvér av ComM. Systemet viste seg óg å verne cellene mot desse lysina. Delesjon av responsregulatoren LiaR medførte ei dobling av lysis ved kompetanse induksjon uavhengig av om ComM var til stades, men i kulturar med eit funksjonelt ComM heldt andelen lyserte celler seg låg. Som i andre Firmicute bakteriar, vart LiaFSR aktivert av dei lipid II interagerande antimikrobielle midla bacitracin og nisin. Microarray analysar av endringar i genekspresjon ved behandling med subletale dosar av bacitracin resulterte i deteksjon av 18 LiaR regulerte gener organisert i seks operon. Delesjon av to av desse gena, spr0810 og pcpC, aleine og i kombinasjon, avslørte at desse to genene er ansvarlige for det meste, men ikkje all den beskyttande effekten av LiaFSR ved kompetanse-induksjon. I den siste delen av studia, rapportert i artikkel III, viste vi ved hjelp av zymogram analysar av protein ekstrakt at CbpD er ein murein hydrolase. CbpD er sett saman av eit N-terminalt CHAP domene etterfulgt av to SH3b domener og eit C-terminalt cholin-bindande domene. Vi fann at eit fusjonsprotein av CbpD med CHAP domenet byta ut med grønt fluoroscerande protein (GFP) i hovudsak bind celledelingssona i pneumokokkar. Delesjosstudier avdekka at det cholinbindande domenet er ansvarleg for denne bindingsspesifisiteten. SH3b domena viste seg å binde peptidoglykan. Vidare studier viste at begge desse bindingsspesifisitetane er naudsynte for at CbpD skal lysere målceller. Til slutt avdekka transmisjonselektronmikroskopi at CbpD påfører rifter i celledelingssona på angripne celler.