Studies of proteins involved in environmental responses of Enterococcus faecalis V583

Abstract

Enterococcus faecalis has traditionally been considered a harmless inhabitant of the gastrointestinal tract of mammals. However, in the past decade E. faecalis has become a major cause of infections in hospitalized patients. Due to a dramatic increase in resistance to most antibiotics, treatment of such infections is difficult. E. faecalis V583 was the first clinical vancomycin-resistant isolate reported in the United States, and the sequencing of its genome was completed in 2003. Increased knowledge of enterococci is crucial for successful development of new methods and therapies to combat the infections that they cause. The main objective of the work described in this thesis was to identify and study proteins involved in environmental responses of E. faecalis V583. The first part of the thesis (Papers I and II) describes a proteomics approach, while the second part describes studies of individual proteins that were selected on the basis of their potential roles in host-microbe interactions (Paper III and IV). In Paper I we identified proteins that were differently expressed after exposure of E. faecalis V583 to bile. Bile is a major stress factor that the bacteria have to cope with in order to survive in the intestinal tract. This study was done using two-dimensional gel electrophoresis combined with mass spectrometry-based identification of differentially expressed proteins. Of a total of 500 proteins visualized on the gels, 53 unique proteins were identified as differently expressed and among these; proteins involved in fatty acid and phospholipid metabolism were overrepresented. The study of Paper I also allowed a comparison of proteome data with (previously generated) transcriptome data. In the study described in Paper II, an enzymatic method for “shaving” of intact cells was combined with high resolution mass spectrometry methods to identify proteins located on the surface of E. faecalis V583. Surface proteins are important for communication and interactions both among bacterial cells and between a bacterium and its environment. This approach led to the identification of 69 unique proteins, of which 36 were predicted to have an extracellular localization. The majority of these proteins are involved in cell wall synthesis, pheromone-regulated processes and transport of solutes. Interestingly, this study yielded several proteins of unknown function that are interesting targets for further research. Paper III describes an endo-β-N-acetylglucosaminidase (EF2863) that could potentially enable E. faecalis V583 to deglycosylate host glycoproteins. It was shown that the endo-β-N- acetylglucosaminidase, EfEndo18A, hydrolyses glycosidic linkages in glycoproteins that contain N-linked glycans of the high-mannose and hybrid-type. This may be relevant for enterococcal survival and behavior in the host since it is predicted that twothirds of the eukaryotic proteins are glycoproteins, including several proteins of the immune system. In addition to being involved in nutrient acquisition, enzymes such as EfEndo18A may also have an effect on the host immune system. In addition to being involved in nutrient acquisition, enzymes such as EfEndo18A may also have an effect on the host immune system. E. faecalis V583 contains a chitinolytic machinery whose expression is known to be regulated in response to various environmental stimuli, including stress factors that may be encountered in an animal host. Paper IV show that E. faecalis V583 can grow on chitin and chitin-derived sugars and describes an enzymological chacterization of a chitinase (EF0361) and a chitin binding protein (EF0362). The chitinase, EfChi18A, is an endochitinase, whereas the chitin-binding protein, EfCBM33A, cleaves glycosidic bonds via an oxidative mechanism and acts synergistically with the chitinase. An ultra-high resolution crystal structure of EfCBM33A revealed details of a conserved binding surface that contains the metal-binding catalytic center. There are several studies in the literature indicating that the role of CBM33s could be more complex than a simple food scavenging role, and that suggest roles in virulence and interactions with host cells. Taken together, these studies have provided novel insights into some of the proteins that may be involved in behavior and impact of enterococci and in their interactions with a human host.

Tradisjonelt har Enterococcus faecalis blitt ansett som en harmløs bakterie som blant annet forekommer i tarm hos pattedyr. De siste tiår har imidlertid dette endret seg, og man har sett en økning i forekomsten av disse bakteriene som årsak til infeksjoner hos pasienter på sykehus. Behandling av infeksjoner forårsaket av enterokokker er vanskelig på grunn av økt resistens mot de fleste typer antibiotika. E. faecalis V583 var det første kliniske vancomycinresistente isolatet som ble rapportert i USA, og genomet var ferdig sekvensert i 2003. Økt kunnskap om disse bakteriene er viktig for å kunne utvikle alternative behandlinger og for å bekjempe infeksjoner som enterokokker forårsaker. Hovedfokuset i denne avhandlingen har vært å studere hvilke proteiner hos E. faecalis V583 som responderer på ulike faktorer i omgivelsene. I den første delen (Artikkel I og II) ble proteomikk brukt for å identifisere proteiner, mens i den andre delen (Artikkel III og IV) ble bestemte proteiner valgt ut og karakterisert på bakgrunn av deres potensielle rolle i interaksjonen mellom vert og mikrobe. I Artikkel I ble proteiner som viste endret ekspresjon som en respons på galle identifisert. Galle er en betydelig stressfaktor bakterier må tilpasse seg med tanke på å overleve i tarmsystemet. Dette ble gjort ved bruk av to-dimensjonell gel elektroforese og masse spektrometri-basert identifisering. Av totalt 500 synlige proteiner på gelene, ble det identifisert 53 proteiner som endret proteinuttrykk etter at galle ble tilsatt. Dette var hovedsakelig proteiner involvert i fettsyre og fosfolipid metabolismen. Dette er tidligere gjort på transkriptom-nivå, noe som gjorde det mulig å sammenligne dataene mellom disse to studiene. I Artikkel II ble proteiner som er lokalisert på overflaten til E. faecalis V583 identifisert og analysert ved enzymatisk "barbering" av bakteriens overflate, væskekromatografi og masse spektrometri. Proteiner som sitter på overflaten spiller en viktig rolle ved kommunikasjon og interaksjon mellom bakterieceller og mellom bakterien og dens omgivelser. Totalt ble 69 proteiner identifisert, 36 av disse var predikert til å være lokalisert på bakteriens overflate. De fleste av disse proteinene er involvert i syntesen av cellevegg, feromonregulerte prosesser og i transport av stoffer over membranen. Flere av proteinene har også ukjent funksjon, og er derfor aktuelle mål for mer inngående studier. Artikkel III beskriver en endo-β-N-acetylglucosaminidase (EF2863) som potensielt kan spalte av sukker fra vertens glykosylerte proteiner. Det ble vist at endo-β-Nacetylglucosaminidase, EfEndo18A, kunne hydrolysere glykosidbindingen i glykoproteiner bestående av N-linkede glukaner bestående av ”high-mannose” og ”hybrid-type”. Dette kan være spesielt relevant for E. faecalis V583 sin evne til overlevelse og adferd i verten, siden det er predikert at 2/3 av eukaryote proteiner er glykoproteiner, inkludert flere proteiner som hører til immunsystemet. I tillegg til å uttnytte karbohydrater/sukkermolekyler som næring kan også en hypotese være at EfEndo18A har en effekt på vertens immunsystem. E.faecalis V583 har et kitinolytisk system, som blir regulert som en respons på ulike stimuli fra omgivelsene, inkludert stress-faktorer som bakterien kan møte i verten. Artikkel IV viser at E.faecalis V583 kan vokse på kitin og sukkere av kitin-derivater og det beskrives en enzymologisk karakterisering av en kitinase (EF0361) og et kitin-bindende protein (EF0362). Kitinasen, EfChi18A, er en endokitinase, mens det kitin-bindende proteinet, EfCBM33A spalter glykosidbindinger ved hjelp av en oksidativ mekanisme og virker synergistisk sammen med kitinasen. En høy-oppløselig krystallstruktur av EfCBM33A synliggjorde detaljer av en konservert bindingsoverflate som inneholder ett metall-bindende katalytisk senter. Litteraturen viser flere studier som indikerer at CBM33 kan ha en mer kompleks rolle enn å bare bidra til få tak i næring, men at den i tillegg kan ha en rolle innen virulens og binding til vertens celler. Sett under ett, har disse studiene gitt ett bedre og nytt innblikk i noen av proteinene hos enterokokker som kan være involvert i adferd og interaksjon med verten.