In vitro characterization of commercial and potential probiotic lactic acid bacteria : interactions with human cells

Abstract

Lactic acid bacteria (LAB), especially bacteria belonging to the genus Lactobacillus, are recognized as common inhabitants of the human gastrointestinal tract and have received considerable attention in the last decades due to their postulated health-promoting effects. Probiotics are defined as “live microorganisms which when administered in adequate amounts confer a health benefit on the host” by FAO/WHO. The main aim of this work was to increase the current understanding of how probiotic bacteria and LAB interact with cells of human origin. Characterization of 18 LAB strains in typical probiotic screening assays revealed that L. reuteri strains tolerate gastric and small intestinal conditions very well, have a high adhesion to cell lines of intestinal origin, and can possibly strengthen the epithelial barrier in vitro over 24 h, thus revealing some interesting characteristics compared to the other strains investigated. Based on these results, strains were selected for further studies to better understand the mechanisms behind the observed diversity. When further investigating the excellent adhesion of L. reuteri we found that the protein encoded by hmpref0536_10633 plays a critical role in binding of L. reuteri ATCC PTA 6475 to Caco-2 cells and mucus in vitro, and we propose that this LPxTG motif containing protein should be referred to as cell and mucus binding protein A (CmbA). Furthermore, L. reuteri ATCC PTA 6475 and DSM 20016 induced the highest cytokine secretion from THP-1 cells and the highest activation of NF-κB in the U937-3xkB-LUC cell line, whereas other known probiotic bacteria such as L. plantarum 299v and L. rhamnosus GG had little effect. The L. reuteri LPxTG protein Hmpref0536_10802 appears to be of importance for the secretion of IL-8 and TNF-α from THP-1 cells. In a Caco-2 model of the intestinal epithelial barrier in vitro we found no further beneficial effect of the selected probiotic bacteria and LAB compared to the control. In general, well documented commercially available strains, such as L. rhamnosus GG and L. plantarum 299v, performed relatively poor compared to other LAB in the typical probiotic screening assays used in this work. However, the ultimate performance criterion of a probiotic strain is the ability to confer health benefits in the host. Nevertheless, in vitro methods are highly important to increase our current understanding of how probiotic bacteria and LAB interact with cells of human origin. The involvements of CmbA in adhesion to intestinal epithelial cells and mucus and Hmpref0536_10802 in immune stimulation of THP-1 cells are two novel contributes to the puzzle that one day will help us to fully understand the interaction between LAB and cells of human origin.

Melkesyrebakterier (MSB), særlig bakterier tilhørende slekten Lactobacillus, er en naturlig del av vår tarmflora og har fått stor oppmerksomhet de siste tiårene på grunn av deres påståtte helsebringende effekt. Probiotika er definert som "levende mikroorganismer som når de gis i tilstrekkelig mengde gir en helsegevinst for verten" av FAO/WHO. Målet for arbeidet i denne avhandlingen var å øke vår forståelse omkring samspillet mellom probiotiske bakterier/MSB og humane celler. Karakterisering av 18 MSB i typiske probiotiske testmetoder viste at stammer av L. reuteri har en god toleranse for mage- og tynntarmssafter, har en sterk evne til å feste seg til tarmcellelinjer, og kan muligens styrke tarmbarrieren in vitro over en periode på 24 timer. L. reuteri utpekte seg således med noen interessante egenskaper sammenliknet med de andre MSB i testen. Basert på dette valgte vi ut noen MSB for videre studier. Da vi undersøkte hva som kan være årsaken til L. reuteris gode bindeevne fant vi at proteinet som er kodet av hmpref0536_10633 var veldig viktig for L. reuteri ATCC PTA 6475s bindeevne til Caco-2- celler og mucus in vitro. Dette nye LPxTG proteinet kalte vi «cell and mucus binding protein A» (CmbA). Det viste seg også at L. reuteri ATCC PTA 6475 og DSM 20016 var de to stammene som førte til den største cytokin sekresjonen fra THP-1-celler og den sterkeste aktiveringen av NF-κB i U937-3xkB-LUC-cellelinjen. Andre kjente probiotiske bakterier som L. plantarum 299v og L. rhamnosus GG hadde liten effekt på THP-1- og U937-3xkBLUC- celler. LPxTG proteinet Hmpref0536_10802 fra L. reuteri ATCC PTA 6475 viste seg å være av betydning for produksjon av IL-8 og TNF-α i THP-1 celler. I et Caco-2- modellsystem for tarmbarrieren fant vi ingen gunstig virkning av de utvalgte probiotiske bakterier og MSB sammenlignet med kontrollen. In vitro test systemer som benyttes i dette arbeidet brukes ofte i utvelgelse av probiotiske kandidater, men det er virkningen i menneske som er den ultimate testen for probiotisk effekt. Denne avhandlingen viser noen interessante eksempler på dette ettersom veldokumenterte kommersielle probiotiske stammer, som for eksempel L. rhamnosus GG og L. plantarum 299v, kom dårlig ut sammenlignet med andre MSB i våre tester. På den andre siden er bruk av in vitro metoder svært viktig for å øke vår forståelse av hvordan probiotiske bakterier og MSB kommuniserer med humane celler. Våre to funn om at CmbA er viktig for feste til tarmceller og mucus, og at Hmpref0536_10802 er viktig for immunstimulering av THP-1 celler, er to brikker i det store puslespillet som en dag vil hjelpe oss til å forstå samspillet mellom MSB og humane celler.