Establishment of confocal microscopy method for detecting double-strand breaks (DSBs) in DNA after radiation

Abstract

Cancer is classified as a pandemic, causing more than 9 million deaths per year. Cancer treatment requires insights into cellular responses to radiation and repair mechanisms of damage. It is much interested in quantifying damage extent over time following radiation because the reduction in damage can be interpreted as a repair rate. Of particular interest is the double-strand breaks (DSB) on DNA because it is a severe form of damage that could potentially cause cell death.

The aim of this study was to develop a method for detecting the number of double-strand breaks (DSB) induced in cells following radiation and characterise the DSB's spatial distribution using 3D reconstructed images obtained by confocal microscopy. Six experiments were conducted on cancerous cells to test the developed method and evaluate the damage extent following irradiation. Methodological development consisted of both determining the protocol for sample preparation and image analysis of the acquired images.

The final protocol for sample preparation used cells attached to the microscope slide and keeping their position through the entire experiment from irradiation to imaging. The benefit of this method is that the damage extent and repair can be view in light of the cells environment. Environmental conditions such as cell density might impact the cellular response.

The measurements of damage extent were consistent with results obtained by using flow cytometry which detects fluorescence intensity. The accuracy of DSB detection is limited to doses of 2 Gy and lower, as the DSB density becomes too high to distinguish at larger irradiation doses. The number of DSBs detected was, however, lower than the theoretically expected value. More investigation into the method's parameters is required for better a DSB count.

Kreft er klassifisert som en pandemi, som forårsaker mer enn 9 millioner dødsfall per år. Kreftbehandling krever innsikt i cellulære reaksjoner på stråling og reparasjonsmekanisme for skade. Det er en stor interesse i å kvantifisere skadeomfang over tid etter stråling fordi reduksjonen i skade kan tolkes som en reparasjonshastighet. Av spesiell interesse er dobbeltstrengbruddene (DSB) på DNA fordi det er en alvorlig form for skade som potensielt kan forårsake celledød.

Målet med denne studien var å utvikle en metode for å oppdage antall dobbeltstrengede brudd (DSB) indusert i celler etter stråling og karakterisere DSBs romlige distribusjon ved bruk av 3D-rekonstruerte bilder oppnådd ved konfokal mikroskopi.

Seks eksperimenter ble utført på kreftceller for å teste den utviklede metoden og evaluere skadeomfanget etter bestråling. Metodologisk utvikling besto av både å bestemme protokollen for prøveforberedelse, og bildeanalyse av de anskaffede bildene.

Den endelige protokollen for prøveforberedelse brukte celler festet til mikroskopets glass og holdt sin posisjon gjennom hele eksperimentet fra bestråling til avbildning. Fordelen med denne metoden er at skadeomfanget og reparasjonen kan sees i lys av cellemiljøet. Miljøforhold som celletetthet kan påvirke cellens respons.

Målingene av skadeomfang var i samsvar med resultater oppnådd ved bruk av flow cytometry som detekterer fluorescensintensitet. Nøyaktigheten av DSB-deteksjon er begrenset til doser på 2 Gy og lavere, ettersom DSB-tettheten blir for høy til å skille ved større bestrålingsdoser. Antallet detekterte DSBs var imidlertid lavere enn den teoretisk forventede verdien. Mer undersøkelse av metodens parametere er nødvendig for en bedre DSB-telling.