Abscission in poinsettia, a methodology and –omics approach
Abstract
Plants detach organs in a highly controlled process called abscission. Leaves, flowers, seeds, fruits, berries and even roots abscise from the plant in response to pathogens or environmental and developmental stimuli. The deciduous plants shed their leaves each autumn and many flowers discard their petals after pollination. Abscission is highly connected to loss of potential yield in productive crops due to affect seed shattering in cereals, harvesting time in fruits, and fruit setting in fruit trees by abscission of the excess of flowers. Therefore, control of abscission has been a part of agricultural practice from the beginning of plant domestication. Additionally, premature abscission might affect the decorative value in ornamental plants, an example being poinsettia (Euphorbia pulcherrima), which is a plant originally from Central America and highly appreciated during the Christmas season. Early flower abscission in poinsettia results in quality reduction and has economic implications for producers, making it a crucial horticultural issue to address.
Organ separation occurs in cell layers normally located at the bottom of the organs, and these cell layers are called the abscission zone (AZ). After receiving physiological cues, the AZ starts a developmental program in which the pectin from the middle lamella is dissolved and the cell wall is degraded to achieve total organ detachment while a protective layer is generated to seal the newly exposed surface.
Although hormonal factors are involved in abscission control, such as auxin-ethylene balance, how these events are coordinated is still largely unknown. The decrease of auxin within the AZ has been postulated as being a prerequisite for abscission to occur, but the full details of the developmental program for abscission remains an area of active research.
This thesis sheds light on the processes behind poinsettia flower bud abscission from three different perspectives. 1) The first approach was development of a methodology to harvest plant materials using the laser microdissection microscope (LMD) coupled to cryosectioning and freeze-drying. The tissue harvested this way is suitable to quantify the auxin levels by GC-MS/MS within the AZ cells of poinsettia flower buds. 2) The second was the use proteomics to explore the changes in abundance of proteins during abscission, taking advantage of spatial and temporal changes during the process of
iv
abscission. 3) Finally, the third approach was the use of transcriptomic to assess the changes in gene expression using a compatible protocol to that employed for the proteomic analyses. The study revealed characteristic patterns of spatiotemporal changes in cell wall transformation-related genes and for auxin related genes, as well as the presence of important abscission genes such as IDA. The results obtained and reported in this thesis support the idea that abscission is a highly complex process and the results unravel some of the processes underpinning abscission regulation. Planter kvitter seg med organer de ikke lenger har bruk for gjennom en svært kontrollert prosess som kalles absisjon. Dette innebærer oftest knopp-, blomster- eller bladfall, men omfatter også frødryss, tap av frukt, bær og til og med røtter. Dette er oftest en respons på patogener, ytre miljø eller stimuli gjennom normal utvikling hos planten. Løvfellende planter slipper sine blad om høsten og mange blomster mister sine kronblad etter pollinering. Absisjon er nært knyttet til tap av mulig avling hos kulturplanter, slik som frødryss før høsting hos kornartene-. Hos frukt og bær er absisjon ofte en selvregulerende prosess der blomster-, kart- og fruktfall bidrar til å redusere fruktsettingen. Å kunne ha kontroll på absisjon har derfor vært viktig siden starten på domestiseringen av planter. I tillegg vil tidlig knopp- og blomsterfall påvirke verdien av prydplanter, for eksempel julestjerne (Euphorbia pulcherrima), en plante som kommer fra Sentral Amerika og er en høyt skattet til jul. Tidlig blomsterfall regnes som en kvalitetsfeil, noe som påvirker prisen til produsent. Alle disse tingene betyr at absisjon er en viktig prosess å ha kontroll på innen jord- og hagebruk.
Tap av plantedeler skjer normalt i cellelag under den delen som planten skal kaste, og dette laget kalles absisjonssonen (AZ). Etter å ha mottatt fysiologiske signaler, begynner absisjonssonen på en utvikling som begynner med at pektiner i midtlamellen brytes ned og celleveggen brytes gradvis ned for å forberede kasting, samtidig som et beskyttende lag dannes der organet faller av. Til tross for at man er klar over at plantehormoner påvirker knop- og blomsterfall (absisjon), vet man ennå ikke hvordan dette reguleres i detalj. Nedgangen i auxin i AZ har blitt postulert som en forutsetning for at absisjon skal kunne skje, men dette er fortsatt et område av stor interesse for forskningen.
Denne oppgaven kaster lys over mange av de prosessene som fører til knopp- og blomsterfall hos julestjerne, fra tre ulike vinkler: 1) Den første artikkelen beskriver utviklingen av en metode for å høste svært små områder i blomsterknoppen ved hjelp av laser mikrodissekeringsmikroskop (LMD), sammen med frysesnitting og frysetørking av materialet. Vev høstet på denne måten kan bevare auxiner (og andre nedbrytbare stoff) for kvantitativ analyse ved hjelp av GC-MS/MS av cellene i absisjonssonen hos julestjerne. 2) Bruk av proteomikk for å utforske endringer i proteinmengde og –sammensetning under absisjonsprosessen, ved å se på endringer i både tid og rom. 3) Den siste artikkelen bruker
vi
transkriptomikk for å beskrive de samme prosessene i tid og rom, men ser på genuttrykk og endringer av disse hos julestjerne. Dette doktorgradsarbeidet avslører karakteristiske mønstre i genuttrykk for tid og rom ved nedbryting av celleveggen og for auxinrelaterte gener. Vi fant for første gang tilstedeværelsen av IDA, som er vist å være viktig for absisjon også i mange andre arter. Resultatene støtter oppfatningen av at absisjon er en svært kompleks prosess, og gir en utvidet forståelse av noen av prosessene som understøtter reguleringen av absisjon hos planter. Las plantas desechan órganos de manera altamente controlada en un proceso denominado abscisión. La abscisión de hojas, flores, semillas, frutos, bayas e incluso raíces es la respuesta fisiológica a estímulos internos y/o ambientales. Las plantas de hoja caduca botan las hojas cada otoño y muchas flores desechan los pétalos después de la polinización. La abscisión está fuertemente conectada al rendimiento en cultivos productivos ya que afecta la dispersión de las semillas en cereales, el tiempo de cosecha de los frutos y el cuaje en árboles frutales debido a la abscisión del exceso de flores. Por lo tanto, controlar la abscisión ha sido una parte importante de las prácticas agrícolas desde el comienzo de la domesticación de las plantas. Asimismo, la abscisión también afecta a plantas ornamentales, disminuyendo su valor decorativo. Un ejemplo es la abscisión precoz de las flores en la Flor del Inca (Euphorbia pulcherrima), planta originaria de Centro América muy cotizada durante la época navideña. La pérdida prematura delas flores en la Flor del Inca causa pérdidas económicas a los productores, por lo cual es en un tema a considerar.
La separación del órgano tiene lugar en la llamada zona de abscisión (ZA) que está ubicada normalmente en la base de los órganos y que está conformada por unas pocas capas celulares que retienen un estado de poca diferenciación. Después de recibir las señales fisiológicas, la ZA comienza un programa de desarrollo en el que la pectina en la lámina media celular se disuelve, las paredes celulares se degradan hasta conseguir la separación completa del órgano mientras una capa protectora se genera para sellar la superficie expuesta.
Aunque factores hormonales como el balance de auxina-etileno, podrían controlar la abscisión, no hay acuerdo en cómo los eventos son coordinados. Se postula que la disminución de hormona auxina dentro de la ZA podría ser una de las causas fundamentales por la que la abscisión ocurre, sin embargo, los detalles del programa de desarrollo continúan siendo un área de activa investigación.
La presente tesis estudia la abscisión floral de la especie Flor del Inca desde tres perspectivas diferentes: 1) La primera es el montaje de una metodología experimental para colectar tejido vegetal por medio del microscopio de disección láser acoplado a crio seccionamiento y liofilización. El tejido colectado con esta metodología es apropiado para
viii
su posterior uso en cuantificación de auxina dentro de la ZA usando GC-MS/MS. 2) La segunda es la aplicación de proteómica para explorar las fluctuaciones en el número de proteínas desde un punto de vista espacio-temporal durante la abscisión. 3) Finalmente, la tercera es el uso de transcriptómica para evaluar los cambios de expresión durante la abscisión en el mismo diseño experimental que la proteómica. Los resultados de este estudio revelaron patrones característicos de cambios espaciotemporales en genes relacionados a la transformación de la pared celular y genes relacionados a auxina, así como también la presencia de importantes genes de abscisión, tales como IDA. Los resultados obtenidos en esta tesis confirman que la abscisión es un proceso altamente complejo y desvela algunos de los procesos subyacentes a la regulación de la abscisión.