Development of embryonic cell culture conditions in Atlantic salmon

Abstract

Potensialet til bruk av induserte pluripotente stamceller har fått mye oppmerksomhet siden deres første produksjon. Disse cellene har en fenotype som ligner embryonale stamceller og kan derfor gi opphav til celler i alle kroppens vev. En vellykket regenerering fra differensiert til en pluripotent celle forbeholder kunnskap om hvilke gener som er aktive i de udifferensierte cellene. Med kjennskap til disse er neste steg å indusere uttrykket av de respektive genene i målcellen. Når cellene har blitt regenerert, er målet å etablere en udødelig cellelinje. Dette avhenger av et optimalisert medium som fremmer cellevekst samtidig som det hemmer celle-differensiering.

I denne oppgaven har RNAseq-data blitt brukt til å se på genuttrykk i embryoniske stamceller hos laks, og identifisere gener involvert i å vedlikeholde en pluripotent fenotype, samt gener assosiert med differensiering. Disse markørene ble testet ved hjelp av qPCR og Western blotting på forskjellige cellestadier under tidlig utvikling. Nanog ble identifisert som en god markør for pluripotent celle, mens Apoa1 og K2c8 var gode markører for differensiering. Roaa ble valgt som kontrollgen, og ble brukt for å normalisere qPCR-dataene. Western blot-analysen av Oct4- og Sox17-antistoffene ga ikke konkluderende resultater, og videre analyse er nødvendig for å validere disse genene som markører for henholdsvis pluripotent og differensiert phenotype.

Forskjellige sammensetninger av medier for dyrking av embryonale stamceller ble også testet i denne studien, og det ble gjort forsøk på å utvikle disse forholdene. Av de fem forskjellige mediene som ble testet, overlevde celler bare i fire av dem. Profileringsnivået var imidlertid for lavt, og brønnene ble aldri konfluente. Ingen av mediene oppfylte sitt formål og ville trenge videre optimalisering.

The potential use of induced pluripotent stem cells has garnered significant attention since their first production. These cells have a phenotype similar to embryonic stem cells and can therefore give rise to cells in all of the body's tissues. A successful regeneration from differentiated to a pluripotent cell depends on knowledge of which genes are active in the undifferentiated cells. With information of these genes, the next step is to induce the expression of the respective genes in the target cell. Once the cells have been regenerated, the goal is to establish an immortal cell line. This depends on an optimised medium that promotes cell growth while inhibiting differentiation.

This study examined gene expression in embryonic stem cells of salmon using RNAseq data to identify genes involved in maintaining a pluripotent phenotype and those associated with differentiation. These markers were tested using qPCR and Western blotting at different cell stages during early development. Nanog was identified as a good marker for the pluripotent phenotype, while Apoa1 and K2c8 were good markers for differentiation. Roaa was chosen as control gene and used to normalise the qPCR data. The Western blot analysis of Oct4 and Sox17 antibodies did not yield conclusive results, and further analysis is required to validate these genes as markers of pluripotency and differentiation, respectively.

Different compositions of media for the cultivation of embryonic cells were also tested in this study, and an attempt was made to develop these conditions. Of the five different media tested, cells only survived in four of them. However, the profiling level was too low, and the wells were never confluent. None of the media fulfilled their purpose and would need further optimisation.