Focal dark spots in the skeletal muscle of Atlantic salmon : involvement of rib abnormalities, environmental factors, and local immune responses

Abstract

Focal dark spots (DS) represent a major fillet quality issue, leading to significant economic losses in farmed Atlantic salmon (Salmo salar L.). DS typically appear as discoloured red/black areas in the anterior hypaxial skeletal muscle, with unknown aetiology. This thesis aims to investigate rib abnormalities and to study their potential association with DS. The thesis also aims to further understand the local immune response in DS by exploring the B cell traffic across different tissues and DS. In Paper I, a classification system for rib abnormalities was developed, based on X-ray images of wild and salmon farmed in a commercial smolt farm, small experimental land-based tanks or commercial sea-cages. Rib cage explorations showed that the number of rib abnormalities doubled after transfer to sea-cages, primarily attributed to resorptive rib morphologies: generalized radiolucent and shorter ribs. Over time, the abnormalities gradually shifted towards fracture-like types, but the total number was maintained. Black DS were only found in salmon farmed in commercial sea-cages, coinciding with the environment with the highest prevalence of rib abnormalities. DS and rib abnormalities shared anatomical location (ribs 11 - 14). Although, rib abnormalities where more concentrated in distal parts, DS were more severe in mid-proximal parts. Black DS exhibited twice as many rib abnormalities as unstained tissue, primarily as various forms of bent and broken ribs, especially of flatter DS shapes. However, DS were also found without any sign of abnormal ribs or fractures. There were signs of recurrent injury processes and pathological interconnections in DS with rib fractures and mechanical deformations. It is concluded that there is an association between rib abnormalities and DS, but additional factors are involved in the DS development. In Paper II, different methods were used to assess morphological rib abnormalities of salmon within the broader musculoskeletal framework. The study focused on harvest-sized salmon (3 kg) reared in experimental tanks on land and fed either marine- or plant-based ingredients during smoltification. Histology showed that 29 % of sampled ribs presented radiolucency without nearby tissue inflammation. The changes involved cartilage core transformation and osteolysis, disorganized appositional growth, collagen and osteoid deposits in compact bone, and increased external collagen layer – resulting in 18 – 20 % increased rib diameter. Salmon fed plant ingredients showed more generalized radiolucency and axis deviations, cooccurring with softer ribs with decreased phosphorus content, and softer skeletal muscle. Rib morphology was more sensitive to dietary composition during smoltification than vertebrae. Small DS were equally found in both dietary groups. The research expands the understanding of the two most prevalent rib abnormalities in Atlantic salmon, axis deviations and especially generalized radiolucency, linking these changes to altered rib development, degeneration, and likely osteomalacia. Paper III combined RT-qPCR of 16 immune genes and Ig-seq of IgM CDR3 sequences in eight fish from Paper I with different DS morphologies. The flatter the DS, the higher the cumulative frequency (CF) of shared B cell clonotypes within DS, gene expression for macrophage, activation of CD4+ and CD8+ cells, and B cell maturation and activity. However, the flatter the DS, the lower the expression of dendritic cells and lymphocyte attenuator genes. Expression of immune genes was generally lower in DS than in the lymphatic organs, head kidney, and spleen, but higher than in normal skeletal muscle. At the earliest stage (increased migm and sigm ratio and minor CF with other tissues), naïve B cells likely migrated from visceral peritoneum fat and skeletal muscle to DS after injury. In further differentiation stages (decreased migm and sigm ratio and high expression of pax5 and cd79), activated B cells from DS were disseminated to the head kidney, visceral peritoneum fat, and spleen. Traffic and expression of immune genes decreased at later stages. B cells differentiation and traffic could be due to a local infectious process, but no bacterial RNA or DNA were detected in DS. Viruses like SAV (7:8), and PRV-1 (2:8) were found in DS, but without correlation to DS morphology, CF, or immune gene expression. In summary, this thesis demonstrates that rib or muscle damage are likely the primary cause of DS. The rearing environment significantly impacts DS aetiology as more severe rib abnormalities and higher DS prevalence are observed in commercial sea-cages than in land-based tanks. Environmentally unspecific immunostimulants common in commercial sea-cages/practices may also affect melanogenesis of injuries. The composition of the diet during smoltification does not influence the development of DS, though it has modulatory effects on long-term musculoskeletal health, manifested by abnormal rib morphology and softer muscle. The location of the injury in the rib cage and local adaptive immune responses are important in developing the condition. B cells primarily migrate from the visceral peritoneum fat and skeletal muscle to DS initiated by unidentified antigens. The thesis highlights the need to create optimized farming conditions to prevent musculoskeletal damage and mitigate the development of DS.

Mørke filétflekker (DS) er en kvalitetsutfordring som fører til betydelige økonomiske tap for oppdrettet atlantisk laks (Salmo salar L.). DS kan være røde eller svarte/grå og de sitter oftest i den fremre delen av bukområdet av fileten. Årsaken til at flekkene oppstår er ukjent. Formålet med denne avhandlingen var å undersøke morfologiske ribbeinsavvik i laks og deres mulige sammenheng med forekomsten av DS. Avhandlingen tok også sikte på å forstå den lokale immunresponsen i DS ved å utforske B-celletrafikken mellom ulike vev og DS. I Paper I ble det utviklet et klassifiseringssystem for ribbeinsavvik, basert på røntgenbilder av villaks og laks oppdrettet i ferskvann og i sjø. Forekomsten av morfologiske ribbeinsavvik doblet seg etter overføring fra ferskvann til kommersielle merder i sjø, men ikke for laks overført til små forsøkskar på land med sjøvann. Ribbeinsavvikene var primært resorptive: ribbein med sentrale oppklaringer og forkortede ribbein. Over tid endret de morfologiske avvikene seg gradvis mot bruddlignende typer, men det totale antallet avvik ble opprettholdt. Svarte DS ble bare funnet i laks oppdrettet i sjømerder, sammenfallende med økt forekomst av ribbeinsavvik. Den høyeste forekomsten av både DS og ribbeinsavvik var på samme anatomiske område, ved ribbein 11 – 14. Selv om forekomsten av ribbeinsavvik var høyest i distale delen av ribbeina, var DS mer alvorlig i midt-proksimale delen. Svarte DS hadde dobbelt så mange ribbeinsavvik som normalt vev, primært bøyde og brukne ribbein og særlig for flate DS. Imidlertid ble det også funnet DS uten tegn til ribbeinsavvik. I de mørke flekkene var det tegn til gjentatte skadeprosesser og patologi i form av ribbeinsbrudd og mekaniske deformasjoner. Det konkluderes med at det er en sammenheng mellom ribbeinsavvik og DS, men at ytterligere faktorer påvirker DS-utviklingen. I Paper II ble morfologiske ribbeinsavvik av laks analysert ved histologiske og mekaniske metoder. Laksen som ble undersøkt veide 3 kg og var oppdrettet i små forsøkskar med sjøvann på land. Laksen ble fôret med et standard kommersielt fôr, bortsett fra under smoltifiseringen i ferskvannsfasen da den fikk fôr med enten marine eller plantebaserte ingredienser. Histologiske undersøkelser viste at 29 % av de analyserte ribbeinene hadde sentral oppklaring, uten nærliggende vevsbetennelse. Kjennetegn for ribbein med sentral oppklaring var bruskkjerne-transformasjon og osteolyse, uorganisert apposisjonell vekst, kollagen- og osteoidavsetninger i kompakt bein og økt ytre kollagenlag - noe som resulterte i 18 - 20 % økt ribbeinsdiameter. Laks fôret med plantebaserte ingredienser hadde generelt mer sentral oppklaring og akseavvik i ribbein, samtidig som ribbeina var mykere med redusert fosforinnhold, og filetene var bløtere. Ribbeinsmorfologien var mer sensitiv for fôrsammensetningen under smoltifisering enn ryggvirvlene. Små DS ble funnet i begge fôrgrupper. Resultatene fra dette forskningsarbeidet gir økt forståelse for akseavvik og fenomenet sentral oppklaring, som er de mest utbredte ribbeinsavvikene i atlantisk laks. De morfologiske avvikene knyttes til endret ribbeinsutvikling, degenerasjon og sannsynligvis tilstanden osteomalasia. Paper III kombinerte RT-qPCR av 16 immungener og Ig-seq av IgM CDR3-sekvenser i åtte fisk fra Paper I som hadde DS med ulike morfologier. Jo flatere DS var, jo høyere var den kumulative frekvensen (CF) av delte klonotyper av B-celler. Det ble samtidig observert uttrykk av markørgener for makrofager, aktivering av CD4+ og CD8+ celler, og for B-cellemodning og aktivitet. Imidlertid, jo flatere DS, jo lavere uttrykk av markører til dendritiske celler og lymfocytthemmere. Uttrykk av immungener var generelt lavere i DS enn i nyre og milt, men høyere enn i normal skjelettmuskulatur. På det tidligste stadiet (en økt migm/sigm-ratio og en lavere CF til andre vev), migrerte sannsynligvis naive B-celler fra innvollsfett og skjelettmuskulatur til DS etter skade. I senere differensieringsstadier (en redusert migm/sigm-ratio og økt uttrykk av pax5 og cd79), ble aktiverte B-celler fra DS spredt til nyre, innvollsfett og milt. Bevegelse mellom vev og uttrykk av immungener avtok i senere stadier. Differensiering av B-celler og bevegelse kan skyldes en lokal infeksjonsprosess, men hverken bakterielt RNA eller DNA ble påvist i DS. Virus som SAV (7:8), og PRV-1 (2:8) ble funnet i DS, men uten korrelasjon til DS-morfologi, CF, eller genuttrykk. Oppsummert viser denne avhandlingen at skader på ribbein eller muskel sannsynligvis er årsaker til DS. Oppdrettsmiljøet påvirker DS-etiologien betydelig ettersom mer alvorlige ribbeinavvik og høyere DS-prevalens ble observert i kommersielle merder i sjø enn i små forsøkskar på land. Uspesifikke immunstimulerende faktorer som kan finnes i oppdrettsmiljøet øker sannsynligvis graden av melanisering. Sammensetningen av dietten under smoltifisering påvirket ikke utviklingen av DS, selv om den hadde modulerende effekter på langsiktig muskel- og skjeletthelse, manifestert som ribbeinsavvik og bløt filet. Hvor skaden oppstår, samt lokale, adaptive immunresponser har betydning for utviklingen av tilstanden. B-celler migrerer primært fra fettet i visceral peritoneum og skjelettmuskulaturen til DS, initiert av uidentifiserte antigener. Avhandlingen understreker behovet for å skape optimale forhold i lakseoppdrett som kan forebygge muskel- og skjelettskader, og slik også redusere risikoen for utvikling av DS.