Establishing efficient transformation technologies for CRISPR/Cas9 genome editing in Lolium perenne L.

Abstract

Den diploide fôrgressarten flerårig raigras (Lolium perenne L.) er den vik?gste fôrgressarten i Europa. Den brukes både i eng og beite og er en avgjørende komponent i husdyrproduksjonen fra drøvtyggere (melk og kjøY) på grunn av god fôrkvalitet og høy fordøyelighet. Den dårlige ?lpasningen ?l kaldt og tørt klima utgjør imidler?d en ubordring i de pågående klimaendringene med tørrere somre og uforutsigbare vintre, slik som i Norge. Et vik?g aspekt for flere gressarter er induksjon av blomstring gjennom vernalisering, definert som en prosess hvor en langvarig kuldeperiode fremmer blomstring i planten. Frysetoleranse og vernalisering har et komplekst forhold med flere molekylære samspill der mange gener er involvert og kan induseres som følge av eksponering med lave temperaturer samt kortere dager.

I denne studien ble to gener vik?ge for vernalisering i flerårig raigras, VRN1 og VIN3, valgt for genredigering ved bruk av CRISPR/Cas9. To flerårige raigrasgenotyper, Fagerlin-201 og Fagerlin-204, som er forskjellige med hensyn ?l vernaliseringskrav og uYrykk for disse to genene under korte og kalde dager, ble brukt som plantemateriale. Disse genotypene ble selektert innen den norske sorten ‘Fagerlin’. Tidligere studier har funnet at induksjonen av VRN1 og VIN3 er betydelig høyere i genotypen som krever vernalisering (Fagerlin-204) sammenlignet med genotypen som blomstrer uten vernalisering.

For begge gener ble knock-out- og overekspresjonskonstruksjoner designet og brukt ?l å transformere kalli av flerårig raigras ved bruk av Agrobacterium tumefaciens-mediert transformasjon. For å gjøre det ble fire gRNA-er designet for hvert gen. Meristema?ske kalli ble produsert fra frø fra sorten ‘Fagerlin’, som senere ble transformert. Det ble også forsøkt å produsere kalli fra blader, embryo og meristemer, men deYe ga ikke de samme posi?ve resultatene.

Frems?llingen av CRISPR/Cas9-konstruksjoner, samt produksjon og transformasjon av flerårig raigraskallus, er ?dkrevende, og demonstrerer ubordringene med å etablere vevskulturmetoder og CRISPR/Cas9-knock-outs i denne arten. Derfor bør det arbeides videre med deYe prosjektet, dvs. fenotypisk validering av de transformerte kalliene, og etablering

3

av meristema?ske kalli- eller protoplastkulturer og transformasjon av de to utvalgte genotypene, Fagerlin-201 og Fagerlin-204.

Etablering av et funksjonelt CRISPR/Cas knockout-system for flerårig raigras er nødvendig for å studere funksjonen ?l gener karakterisert gjennom transkriptom og QTL (Quan?ta?ve Trait Loci) studier. DereYer kan slik informasjon implementeres og brukes ?l å forbedre presisjonen av genomisk-baserte foredlingsmetoder, redusere lengden på foredlingsprogrammet, og dermed raskere utvikle nye sorter med forbedret toleranse mot stress som frost og tørke.

The diploid forage grass species perennial ryegrass (Lolium perenne L.) is the most important forage grass species in Europe. It is used both in leys and pastures and is a crucial component of ruminant livestock produc?on (milk and meat) due to its good nutri?onal values and high diges?bility. However, its poor adapta?on to cold and dry climates poses a challenge in the ongoing climate changes with drier summers and unpredictable winters, such as in Norway. An important aspect for several grasses is the induc?on of flowering through vernaliza?on, defined as a process where a prolonged cold period promotes flowering in the plant. Freezing tolerance and vernaliza?on have a complex rela?onship with several molecular cross-talks where many genes are involved and can be induced as a result of exposure to low temperatures as well as shorter days.

In this study, two genes important for vernaliza?on in perennial ryegrass, VRN1 and VIN3, were selected for gene edi?ng using CRISPR/Cas9. Two perennial ryegrass genotypes, Fagerlin-201 and Fagerlin-204, which differ regarding vernaliza?on requirements and expression of these two genes during short and cold days were used as plant material. These genotypes were selected within the Norwegian cul?var ‘Fagerlin’. Previous studies have found that the induc?on of VRN1 and VIN3 is significantly higher in the genotype requiring vernaliza?on (Fagerlin-204) compared to the genotype that flowers without vernaliza?on.

For both genes, knock-out and overexpression constructs were designed and used to transform perennial ryegrass calli using Agrobacterium tumefaciens mediated transforma?on. To do so, four gRNAs were designed for each gene. Meristema?c calli were produced from seeds from the perennial ryegrass cul?var ‘Fagerlin’, which were later transformed. Calli from leaves, embryos and meristems were also aYempted to be established, however this did not yield the same posi?ve results.

Genera?ng CRISPR/Cas9 constructs, as well as the produc?on and transforma?on of perennial ryegrass callus, is ?me-consuming, and demonstrate the challenges of establishing ?ssue culture methods and CRISPR/Cas9 knock-outs in this species. Therefore, further work should be done on this project such as phenotypic valida?on of the transformed calli, and

1

establishment of meristema?c calli or protoplast cultures and transforma?on of the two selected genotypes, Fagerlin-201 and Fagerlin-204.

Establishing a func?onal CRISPR/Cas knockout system for perennial ryegrass is needed for studying the func?on of genes characterized through transcriptomic and QTL (Quan?ta?ve Trait Loci) studies. Subsequently, such informa?on can be implemented and used to improve the precision of genomic based breeding methods, reduce the length of the breeding cycle, and thus more rapidly develop new cul?vars with improved tolerances against stresses like frost and drought.