Supercooling as an Alternative to Chemical Cryopreservation and Implications for Nuclear bodies

Abstract

De fleste analyser som benyttes i dag for å studere genomet og dets romlige organisering er ikke i stand til å identifisere genomiske områder som er midlertidig forbundet med en cellekjernes kjernelegemer i rom og tid. Dette skyldes at de eksperimentelle forholdene som blir brukt endrer det kjemiske eller fysiske miljøet i eller rundt genomet og påvirker den nært forbundne og følsomme strukturen til kjernelegemene. Denne avhandlingen undersøker om dyp underkjøling uten isdannelse kan bevare den strukturelle integriteten til isolerte hepatocytt-cellekjerner fra atlanterhavslaks (Salmo salar), og et kjernelegeme til stede i dem kalt nukleolus. Funnene rapportert i denne avhandlingen antyder at dyp underkjøling kan brukes til å lagre cellekjerner av høy kvalitet uten ekstra kryobeskyttelse ned til −15.3oC, uten observerbar forringelse etter >2 ukers lagring. Flere andre observasjoner gjort i forbindelse med dette arbeidet kan danne grunnlaget for videre vitenskapelige undersøkelser. Av dem er det verdt å bemerke en mulig observasjon av en underkjøling-fremkalt overgang for nukleolus, fra en miljøfølsom struktur, til en struktur som reagerer lite på ytre påvirkning. Hvis denne underkjøling-fremkalte effekten, som må bekreftes i andre studier, representerer et generelt fenomen for strukturer beriket med proteiner uten veldefinert struktur, vil dette trolig ha implikasjoner for studiet av også andre kjernelegemer.

Most of the assays used today to study the genome and its physical topography, cannot identify the spatiotemporal genomic regions associated with the majority of different nuclear bodies. This is because the experimental conditions commonly used in these assays alter the chemical or physical environment around the genome and influence the closely linked and sensitive structure of nuclear bodies. This thesis explores whether supercooling without ice formation could preserve the structural integrity of isolated nuclei from Atlantic salmon (Salmo salar) hepatocytes, and a nuclear body contained within them, the nucleolus. The findings reported in this thesis suggests that supercooling can be used to store high-quality nuclei without additional cryoprotectants down to −15.3oC, with unnoticeable deterioration after >2 weeks storage. Several other observations during this work could form the basis for new scientific enquiries. The most notable being the possible observation of a supercooling-induced transition of nucleoli from an environmental sensitive structure to a largely insensitive structure. If the supercooling-induced effect, which needs to be confirmed in further studies, represent a general phenomenon for structures enriched in intrinsically disordered proteins, this would likely have implications for the study of other nuclear bodies.