Development of CRISPR screenable phenotypes for PCV2 in pig cells and detection of latent BVDV contamination in commercial FBS

Abstract

Genome-wide CRISPR screening er et kraftig forskningsverktøy som gjør det mulig å undersøke virkningen av spesifikke gener i ulike biologiske prosesser, som for eksempel overlevelsesevne, fenotypeutvikling eller sykdomsprosesser. Ved å bruke CRISPR-teknologi for å slå ut eller modifisere gener, kan forskere identifisere potensielle mål for legemidler eller avdekke ny innsikt i cellulære mekanismer. Dette studiet er en del av et større prosjekt der hovedmålet er å oppdage genkandidater som gir griser resistens mot PCV2 ved bruk av Genome-wide CRISPR knockout screening (GeCKO) som er et verktøy for mer presis og effektiv avl. Studiet hadde som mål å utvikle en protokoll for dyrking av PCV2 i PK-15 celler og identifisere en passende cellelinje med detekterbare cytopatiske effekter ved infeksjon av PCV2. prosjektet. I tillegg ønsket vi å finne en BVDV-fri kilde til FBS for å forhindre kontaminasjon i MDBK-celler, en cellelinje som vil bli brukt i GeCKO screening.

Evaluering av levedyktighet i PK-15 celler infisert med PCV2 viste tilstedeværelse av virusinduserte cytopatiske effekter, spesielt ved lavere celletetthet. Det er nødvendig med ytterligere optimalisering og oppskalering av den eksperimentelle prosedyren for å sikre reproduserbare og pålitelige resultater for GeCKO screeningapplikasjoner. Vi forsøkte å utvikle en screenbar fenotype basert på virusinduserte aktinforandringer, men disse eksperimentene var mislykkede og krever optimalisering av prosedyre. Vi avdekket betydelige forskjeller i cellevekst og levedyktighet i PK-15-celler infisert med PCV2 sammenlignet med mock infiserte celler, noe som indikerer den betydelige effekten av PCV2-infeksjon på cellulær helse. PCR og agarose gelelektroforese bekreftet tilstedeværelsen av PCV2 i infiserte PK-15 celler, og Real-Time PCR hadde vellykket amplifisering av PCV2 viralt DNA og viste suksessfull virusreplikasjon. BVDV kontaminasjon ble identifisert i den første analysen av MDBK celler dyrket med forskjellige FBS batcher. Påfølgende testing ved hjelp av en BVDV-fri MDBK cellelinje bekreftet FBS som kilden til kontaminasjon. En BVDV-fri batch av FBS ble innhentet og løste kontamineringsproblemet for fremtidig bruk i GeCKO screening.

Forskningen i dette studiet bidrar til utvikling av CRISPR-verktøy for produksjonsdyr og legger grunnlaget for flere genredigeringsmuligheter, noe som potensielt kan føre til bedre dyrehelse og kostnadsbesparelser i avlsindustrien.

Genome-wide CRISPR screening is a powerful research tool that enables scientists to investigate the roles of specific genes in various biological processes, such as cell survival, phenotype development, or disease pathways. By using CRISPR technology to knockout or modify genes on a genome-wide scale, researchers can identify potential drug targets or uncover novel insights into cellular mechanisms. This study is a part of a bigger project where the main goal is to discover gene candidates for PCV2 resistance in pigs using genome-wide CRISPR knockout screening (GeCKO) as a tool for more precise and efficient breeding. This study aims to develop a protocol for PCV2 cultivation in PK-15 cells and identify a suitable cell line with detectable cytopathic effects upon infection. In addition, the study sought to find a BVDV-free source of FBS to prevent contamination in MDBK cells, a cell line that will be used in GeCKO screening.

The evaluation of cell viability in PCV2 infection experiments demonstrated the presence of viral-induced cytopathic effects, particularly at lower cell densities. However, further optimization and scaling up of the experimental procedure are needed to ensure reproducibility and reliability for GeCKO screening applications. We attempted to develop a screenable phenotype based on virus mediated actin remodeling, however these experiments were unsuccessful, and require optimization of the method. We revealed significant differences in cell growth and viability in PK-15 cells infected with PCV2 compared to mock infected cells, indicating the substantial impact of PCV2 infection on cellular health. PCR and agarose gel electrophoresis confirmed the presence of PCV2 in infected PK-15 cells, and Real-Time PCR demonstrated successful amplification of PCV2 viral DNA showing successful replication. BVDV contamination was identified in the initial testing of MDBK cells grown with different FBS batches. Subsequent testing using a BVDV-free MDBK cell line confirmed FBS as the source of contamination. A BVDV-free batch of FBS was obtained, resolving the contamination issue for future use in GeCKO screening.

This research contributes to the development of CRISPR tools for production animals, paving the way for more gene-editing possibilities and potentially leading to better animal health and cost savings in the breeding industry.