Diagnostiske verktøy for måling av cytokiner hos rein (Rangifer tarandus tarandus)

Abstract

Bakgrunn for studien: Det finnes i dag ingen kommersielle metoder for deteksjon av cytokiner hos rein (Rangifer tarandus tarandus). Økt smittepress i forbindelse med at tamreinen oftere fôres og holdes i gjerde, har medført et større behov for diagnostiske verktøy for å kartlegge reinhelsen.

Mål: Målet med studien var å kartlegge om, og i hvor stor grad, en kulebaserte multipleks cytokinanalyse beregnet til storfe, kunne brukes på prøver fra rein, og vurdere potensialet til de ulike cytokinene som biomarkører. I tillegg ville det bli designet primere for å måle genuttrykket for de samme cytokinene, som et sammenligningsgrunnlag for den multiplekse cytokinanalysen.

Metoder: Perifere mononukleære celler (PBMC) fra rein og storfe (Bos taurus) ble isolert fra blod, og stimulert in vitro med mitogenene pokeweed mitogen (PWM), phytohemagglutinin (PHA), concanavalin A (ConA), lipopolysakkard (LPS), staphylococcal enterotoxin B (SEB) og phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) i kombinasjon med ionomycin (I) i 6 eller 24 timer for å indusere cytokinrespons. Cytokinnivåene for interleukin (IL)-6, IL-8, IL-10, IL-17, tumor nekrose faktor-alfa (TNF-α) og interferon-gamma (IFN-γ) ble målt ved bruk av den kulebaserte multiplekse analysemetoden, MILLIPLEX® Bovine Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel 1. Resultatene ble sammenlignet mot genuttrykket målt ved sanntids-polymerase kjedereaksjon (qPCR). For å kunne utføre qPCR ble det designet primere til både rein og storfe for IL-8, IL-10, IL-17, TNF-α og IFN-γ, med beta-2-microglobulin (β2M) som referansegen.

Cytokinnivåer ble også målt i serumprøver fra to tidligere utførte eksperimentelle smitteforsøk på rein, med hhv. Orf-virus (ORFV) (Tryland et al., 2013) og cervid herpesvirus 2 (CvHV2) (das Neves et al., 2009a).

Resultater: Resultatene indikerte at cytokinene IL-8, IL-10, IL-17, TNF-α og IFN-γ detekteres i prøver fra rein med MILLIPLEX® Bovine Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel 1. Stimulering med PMA-I viste seg å være mest optimal for å aktivere cytokinproduksjon, og ga signifikant økt konsentrasjon av IL-10, IL-17, TNF-α og IFN-γ, for både rein og storfe. Det var generelt noe lavere cytokinnivåer hos rein enn storfe, og dette gjaldt spesielt TNF-α. Cytokinkonsentrasjonene var stort sett høyere etter 24 timer stimulering, sammenlignet mot 6 timer. I serumprøver fra smitteforsøk var det målbare nivåer av IL-8, IL-10, TNF-α og IFN-γ, men kun nivået av IFN-γ økte signifikant etter infeksjon, og da bare ved smitte med CvHV2. Alle primere til rein så ut til å fungere godt basert på funn ved gelelektroforese og PCR-effektivitet. Sekvensering av PCR-produkt var imidlertid ikke vellykket for IL-17, og burde gjentas for å sikre at rett sekvens amplifiseres. Det ble også designet primere for storfe, men PCR-effektivitet, gelelektroforese og sekvensering, tilsier at flere av primerne ikke var optimale, og genuttrykket for storfe må derfor tolkes med forsiktighet.

Konklusjoner og potensiell relevans: Resultatet av denne studien tyder på at den multiplekse cytokinanalysen kan brukes for å måle konsentrasjonen av IL-10, IL-17, og IFN-γ i prøver fra rein, og de fleste primere som ble designet kan benyttes for å måle genuttrykk ved qPCR hos denne arten. Det ble observert gjentatte problemer knyttet til standardkurven for IL-8, slik at målte nivåer ikke alltid kunne konverteres til konsentrasjonen. IL-6 ble ikke påvist i prøver fra rein, men siden stimulering med mitogener også førte til lav produksjon av dette cytokinet i prøver fra storfe, kan det ikke utelukkes at den multiplekse analysemetoden likevel kan brukes for å påvise IL-6 hos rein.

Selv om ytterligere undersøkelser i større prøvesett er påkrevd, viser denne studien potensialet av den multiplekse analysemetoden, og qPCR, som diagnostiske verktøy for å måle cytokiner i rein.

Reason for performing study: There are currently no commercial methods for detecting cytokines in reindeer (Rangifer tarandus tarandus). Increased infection pressure due to semi-domesticated reindeer being kept in fenced areas and fed more often has led to a greater need for diagnostic tools to map out reindeer health.

Objectives: The aim of the study was to decide whether, and to what extent, a bead-based multiplex cytokine assay intended for cattle could be used on samples from reindeer, and to assess the potential of the various cytokines as biomarkers. In addition, primers would be designed to measure the gene expression of the same cytokines, as a basis of comparison for the multiplex cytokine analysis.

Methods: Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from reindeer and cattle (Bos taurus) were isolated from blood and stimulated in vitro with the mitogens pokeweed mitogen (PWM), phytohemagglutinin (PHA), concanavalin A (ConA), lipopolysaccharide (LPS), staphylococcal enterotoxin B (SEB) and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) in combination with ionomycin (I) for 6 or 24 hours to induce cytokine response. Cytokine levels for interleukin (IL)-6, IL-8, IL-10, IL-17, tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and interferon-gamma (IFN-γ) were measured using the bead-based multiplex assay method, MILLIPLEX® Bovine Cytokine / Chemokine Magnetic Bead Panel 1. The results were compared with gene expression measured by real-time polymerase chain reaction (qPCR). In order to perform qPCR, primers were designed for both reindeer and cattle for IL-8, IL-10, IL-17, TNF-α and IFN-γ, with beta-2-microglobulin (β2M) as reference gene.

Cytokine levels were also measured in serum samples from two previously carried out experimental infection trials on reindeer, with Orf virus (ORFV) (Tryland et al., 2013) and cervid herpesvirus 2 (CvHV2) (das Neves et al., 2009a).

Results: The results indicated that the cytokines IL-8, IL-10, IL-17, TNF-α, and IFN-γ can be detected in samples from reindeer with the MILLIPLEX® Bovine Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel 1. Stimulation with PMA-I proved to be most optimal for activating cytokine production and resulted in significantly increased concentrations of IL-10, IL-17, TNF-α and IFN-γ, for both reindeer and cattle. There were generally lower cytokine levels in reindeer compared to cattle, and this particularly applied to TNF-α. Cytokine concentrations were generally higher after 24 hours of stimulation, compared to 6 hours. In serum samples from infection trials, there were measurable levels of IL-8, IL-10, TNF-α and IFN-γ, but only the level of IFN-γ increased significantly after infection, and only when infected with CvHV2. All reindeer primers appeared to work well based on gel electrophoresis findings and PCR efficiency. However, sequencing of the PCR product was not successful for IL-17 and should be repeated to ensure that the correct sequence is amplified. Primers for cattle were also designed, but PCR efficiency, gel electrophoresis and sequencing indicate that several of the primers were not optimal and the gene expression for cattle must therefore be interpreted with caution.

Conclusions and potential relevance: The results of this study suggest that the multiplex cytokine assay can be used to measure the concentration of IL-10, IL-17, and IFN-γ in samples from reindeer, and that most of the primers that were designed can be used for measuring gene expression by qPCR in this species. Repeated methodological problems related to the standard curve for IL-8 were observed as measured levels of fluorescence could not always be converted to the concentration. IL-6 was not detected in samples from reindeer, but since stimulation with mitogens also led to low production of this cytokine in samples from cattle, it cannot be ruled out that the multiplex analysis method can still be used to detect IL-6 in reindeer.

Although further investigations in larger sample sets are required, this study shows the potential of the multiplex analysis method and qPCR as diagnostic tools for measuring cytokines in reindeer.