Potato soft rot Pectobacteriaceae in Norway – seed potato health, association with insects and molecular mechanisms of disease development

Abstract

Soft rot Pectobacteriaceae are among the most problematic pathogens of a wide variety of crop plants and ornamentals. Among their hosts is potato, the most important food crop in Norway, where the bacteria cause soft rot of the tubers and blackleg of the stem. The soft rot Pectobacteriaceae currently comprise 18 recognized bacterial species of the genera Dickeya and Pectobacterium, which are somewhat diverse in aspects like geographical distribution, preferred temperature for growth and virulence, typical host range, as well as the disease symptoms they cause on different hosts. Nevertheless, they all feed on rotten host tissue, which they macerate by secreting a variety of plant cell wall degrading enzymes into the intercellular space. In this work, several aspects of soft rot Pectobacteriaceae biology and virulence were investigated with the ultimate goal of contributing to the improvement of potato seed health. To gain more insight into the taxonomy and phylogeny of these pathogens, the genome sequencing of two isolates, which appeared atypical in previous phylogenetic analysis, was performed. This lead to the description of the new species Pectobacterium polaris, which subsequently was found in old isolate collections in Poland and the Netherlands. The identification of this new species may lead to improved detection tools, which facilitate sensible management strategies. The health of Norwegian potato seed of varied quality and different cultivars was assessed in a three-year field study. This was done to investigate the influence of environmental and host factors, as well as testing the implementation of large scale molecular testing of the pathogens’ infection prevalence. The bacteria were found to be near-ubiquitous, regardless of potato cultivar or seed quality, except for seed of the highest quality. These tubers quite reliably tested low in infection prevalence and disease was rarely observed compared to lower quality seed. Climate, particularly precipitation seemed to play the most important role in infection prevalence. Disease incidence for blackleg was partially determined by the host, as demonstrated by one cultivar (Innovator), which seemed less susceptible to this disease. It also performed best in a test, where tubers from 15 different cultivars were infected with P. polaris and P. atrosepticum. In this test, it was also shown that temperature was the factor that had the overall largest influence on rot outcome. This study gave insight into the status of Norwegian seed potatoes in regard to soft rot and important environmental factors in disease. In addition, a two-year field study was performed to examine the presence of the pathogens in insects that were caught in potato fields. The insect were tested by qPCR, which allowed the selection of specimens which contained a high amount of bacteria. These insect were identified by DNA sequencing, and were found to belong to over 90 different species. In the two years, 15 and 20 % of tested insects contained a high amount of soft rot bacteria. A high percentage of insects in a field where clean seed potatoes were grown, was carrying the bacteria, which is highly relevant, because it is not clear how clean seed potatoes are initially infected. Remarkably, the seed corn maggot (Delia platura) was the species that most often carried a high amount of the bacteria. The same species and closely related flies were previously shown to transmit the bacteria to potato and other plants. By showing the high number of insects that carried the soft rot bacteria, and identifying the insects as known vector species, it was demonstrated that insects may play a much more important role in the infection of clean seed than previously assumed. Furthermore, the transcriptomes of the type strain of P. polaris, as well as a strain of P. carotovorum subsp. carotovorum were analysed during early and progressing tuber infection by RNA sequencing. This was done to examine the regulation of virulence factors in the bacteria over the development of disease. In both examined strains, important virulence genes, encoding e.g. the enzymes that degrade host cell walls, as well as several bacterial secretion systems, decreased in expression over time. This, indicated a shift in prioritized function in the investigated bacteria. A better understanding of the molecular processes and their trajectory in progressing infection may help in devising and optimizing counterstrategies.

Bløtråtebakterier er blant de mest problematiske skadegjørere i mange forskjellige kulturplanter, inkludert potet der de forårsaker sykdommene bløtråte og stengelråte. Bløtråtebakterier består per i dag av 18 kjente bakteriearter fra slekten Dickeya og Pectobacterium. Disse er noe ulike med hensyn på geografisk distribusjon, foretrukket temperatur for vekst og sykdomsspredning (virulens), typisk vertsspekter, i tillegg til hvilke sykdomssymptomer de gir. De likevel næres alle av vertens råtne vev, som de bløter opp ved å skille ut en rekke plantecelleveggdegraderende enzymer i det intercellulære rommet. Dette arbeidet har undersøkt flere aspekt ved bløtråtebakteriers biologi og virulens. Målet har vært å bidra til forbedring av settepotetenes helse. For å få bedre innsikt i taksonomi og fylogeni av disse bakteriene, har genomene blitt sekvensert av to isolat som virket atypiske i tidligere fylogenetiske analyser. Dette førte til beskrivelse av den nye arten Pectobacterium polaris, som etterpå ble funnet igjen i eldre samlinger av isolat i Polen og Nederland. Identifiseringen av denne nye arten kan føre til forbedrede deteksjonsmetoder, som igjen kan gjøre det lettere å tilrettelegge for tilpassede bekjempelsesstrategier. En treårig feltstudie ble også gjennomført, der helsen til norske settepoteter av ulike sorter og varierende kvalitet ble vurdert. Dette ble gjort for å undersøke faktorer knyttet til potetsorter og miljø, i tillegg til å teste implementeringen av storskala molekylær testing av utbredelsen av bløtråtebakterier. Undersøkelsen viste at bløtråtebakterier var nesten allestedsnærværende, uavhengig av potetsort og kvalitet. Et unntak var knoller av høyeste kvalitet. Disse knollene testet nokså pålitelig lavt i infeksjonsutbredelse, og sammenlignet med i knoller av lavere kvalitet, var sykdom sjeldent observert. Klima, og særlig nedbør, spilte den viktigste rolle for infeksjonsutbredelse. Forekomst av stengelråte var delvis bestemt av potetsorten. Dette kom særlig fram i en sort (Innovator), som var minst mottakelig mot denne sykdommen. Den kom også best ut i en test, der 15 forskjellige sorter ble infisert med P. polaris og P. atrosepticum. I denne testen kom det også fram at temperatur var den faktoren som hadde størst effekt på utvikling av råten. Denne studien ga innsikt i helsestatusen til norske settepoteter med hensyn på bløtråte og viktige miljøfaktorer som påvirker sykdommen. I tillegg ble en toårig feltstudie gjennomført for å undersøke tilstedeværelse av bløtråtebakterier i insekter som ble fanget i potetåkrer. Insektene ble testet med qPCR, som gjorde det mulig å velge ut eksemplarer som inneholdt store mengder bakterier. Disse insektene ble identifisert med DNA-sekvensering, og viste seg å tilhøre over 90 ulike arter. I løpet av de to årene, inneholdt 15 og 20 % av de testede insektene store mengder av bløtråtebakterie, inkludert et felt der rene settepoteter ble dyrket. Dette er interessant fordi man ikke sikkert vet hvordan settepoteter blir først infisert. Bønneflue (Delia platura) var den arten som oftest bar med seg store mengder av bakterien. Den samme arten, og nært beslektede fluer, har i tidligere studier vist seg å overføre bakterien til poteter og andre planter. Det høye antallet insekter som var bærere av bløtråtebakterier og identifisering av kjente vektorarter, viste at insekter potensielt spiller en mye viktigere rolle i smitte av rene poteter enn først antatt. Transkriptomet av typestammen til P. polaris, i tillegg til en stamme av P. carotovorum subsp. carotovorum, ble analysert under infeksjon av potetknoller ved hjelp av RNA-sekvensering. Dette ble gjort for å undersøke regulering av virulensfaktorer i bakterien i ulike utviklingsstadier av sykdommen. I begge de undersøkte stammene ble viktige virulensgener, som f.eks. koder for enzymer som bryter ned vertens cellevegg, i tillegg til flere bakterielle sekresjonssystemer, redusert i uttrykk over tid. Dette indikerte et skifte i de prioriterte funksjonene i den undersøkte bakterien. Bedre forståelse av de molekylære prosessene og framdrift av infeksjonen, kan hjelpe med å utvikle og optimalisere bekjempelsesstrategier.