Methods to study fusion activation of infectious salmon anaemia virus
Abstract
Infectious salmon anaemia (ISA) is a serious viral disease caused by virulent ISA virus (ISAV). ISA is considered to be an important threat to Norwegian salmon farming. It is a widely held view that new virulent ISAV variants can arise from a reservoir of non-virulent ISAV-HPR0. The transition to virulence is associated with typical changes in the ISAV surface proteins that appears to enhance viral fusion. The mechanisms behind the enhanced fusion are not completely understood. More knowledge on fusion in non-virulent and virulent ISAV variants is necessary to understand the basis for ISAV virulence. Eventually, this could help us address central questions, like how ISAV HPR-del emerges and, if possible, how to limit the formation of new ISAV HPR-del variants. However, differences between non-virulent and virulent ISAV have been difficult to address experimentally because cultivation of ISAV-HPR0 has been challenging. The main aim of this thesis was to establish a tool box to study ISAV fusion, by using a CHSE cell line transfection-based model and erythrocytes to mimic the fusion process. CHSE cells were transfected with plasmids encoding HE and F proteins from closely related ISAV-HPR0 and HPR-del variants. Our hypothesis, based on previous studies, was that the non-virulent ISAV-HPR0 and the virulent HPR-del variants have similar receptor-binding and -destroying activities. Additionally, that the virulent HE/F variant combination has a higher activity of fusion compared to the non-virulent HE/F variant, in line with the current hypothesis that ISAV virulence is related to fusion activity. Functional analyses were performed on recombinantly expressed HE proteins to evaluate and compare receptor binding and -destroying activities. A lipid mixing assay was established to study and compare the fusion activity of recombinantly expressed HE and F proteins when priming and triggering was stimulated by trypsin and low pH.
The recombinantly expressed HPR0 and HPR-del HE showed similar receptor binding and destroying activities, in line with our hypothesis and a previous report [1]. Higher fusion activity was found for the HE and F proteins associated with the HPR-del virus variant than for those associated with the HPR0 virus variant. This was in line with our hypothesis and previous reports [2-4] that fusion activity relates to virulence. No fusion activation was seen in wells with single transfection of HE or F proteins. Additionally, single transfection of F protein did not reveal haemadsorption. Moreover, no fusion activation was observed in the absence of trypsin and low pH treatment for HPR-del HE/F, in contrast to a report by Fourrier et al. [3], that reports significant spontaneous fusion activity.
The work in this thesis has generated data and established methodology that form the basis for future fusion activity studies to understand the mechanisms involved in the ISAV fusion process and the impact of virulence-associated changes in ISAV surface proteins. Infeksiøs lakseanemi (ILA) er en alvorlig virussykdom forårsaket av virulent ILA-virus (ILAV). ILA anses å være en viktig trussel mot lakseoppdrett i Norge. Det er en utbredt oppfatning at nye virulente ILAVvarianter kan oppstå fra et reservoar av ikke-virulent ILAV-HPR0. Overgangen til virulens er assosiert med typiske endringer i ILAV-overflateproteiner som ser ut til å forbedre viral fusjon. Mekanismene bak fusjonsprosessen hos ILAV er ikke fullstendig kjent. Mer kunnskap om fusjon i ikke-virulente og virulente ILAV-varianter er nødvendig for å forstå grunnlaget for ILAV virulens. På sikt kan dette hjelpe oss med å ta opp sentrale spørsmål, som hvordan ILAV HPR-del oppstår og, hvis mulig, hvordan man begrenser dannelsen av nye ILAV HPR-del varianter. Imidlertid har forskjeller mellom ikke-virulent og virulent ILAV vært vanskelige å studere, fordi dyrking av ISAV-HPR0 har vært svært utfordrende. Hovedmålet med denne oppgaven var å etablere en verktøykasse for å studere ILAV-fusjon, ved å bruke en CHSE cellelinje transfeksjonsbasert modell og erytrocytter, for å etterligne fusjonsprosessen i ILAV. CHSE-celler ble transfektert med plasmider som koder for HE- og F-proteiner fra nært beslektede ILAV-HPR0- og HPR-del-varianter. Vår hypotese, basert på tidligere studier, var at den ikkevirulente ILAV-HPR0 og den virulente HPR-del-varianten har liknende reseptorbindende og -ødeleggende aktiviteter. I tillegg, at den virulente HE/F-varianten har en høyere fusjonsaktivitet sammenlignet med den ikke-virulente HE/F-varianten, i tråd med den nåværende hypotesen om at ILAV-virulens er relatert til fusjonsaktivitet. Funksjonelle analyser ble utført på rekombinant uttrykte HE-proteiner for å evaluere og sammenligne reseptorbindende og -ødeleggende aktiviteter. En lipid mixing assay ble etablert for å studere og sammenligne fusjonsaktiviteten i rekombinant uttrykte HEog F-proteiner når priming og triggering ble stimulert av trypsin og lav pH.
De rekombinante HPR0- og HPR-del HE-proteinene viste liknende reseptorbindende og -ødeleggende aktiviteter, i tråd med vår hypotese og en tidligere studie [1]. Høyere fusjonsaktivitet ble funnet for HE- og F-proteiner assosiert med HPR-del-virusvarianten enn for de assosiert med HPR0- virusvarianten. Dette var i tråd med vår hypotese og tidligere rapporter [2-4] om at fusjonsaktivitet er relatert til virulens. Ingen fusjonsaktivitet ble observert i brønner med enkelt-transfeksjon av HE- eller F-proteiner. I tillegg ble det ikke observert hemadsorpsjon i brønner med enkelt-transfeksjon av Fprotein. Dessuten ble ingen fusjonsaktivitet observert i fravær av trypsin og lav pH-behandling for HPR-del HE/F, i motsetning til en rapport fra Fourrier et al. [3], som rapporterer spontan fusjonsaktivitet. Arbeidet i denne oppgaven har generert data og etablert metodikk som danner grunnlaget for fremtidige studier for å forstå mekanismene involvert i fusjonsprosessen hos ILAV, og hvilken effekt de endringene i ILAVs overflateproteiner har for virulens.