Long term biological effects of ionizing radiation on the eye development in gamma-irradiated Atlantic salmon embryos

Abstract

Organisms are at their most sensitive to ionizing radiation during the embryonic life stage, and the eye is one of the most sensitive tissues. High proliferation-rate, cell-differentiation and embryonic development depend on intact DNA and other biomolecules. In the present study, eyes of Atlantic salmon (Salmo salar) were studied at the stage of transition between alevin and fry, after a three-month recovery period from exposure to γ-radiation at dose-rates of 1, 10, and 20 mGy/h during the entire embryonic development. Long-term effects on development of eyes were assessed through histological methods, and molecular responses were investigated through immunofluorescence. In addition, effect of ionizing radiation on development of cataract was investigated by use of molecular marker responses. Whole eyes from non-irradiated salmon parr were also dissected and analyzed for documentation of potential effects associated with formalin fixation and its implications for histochemical analysis of eye-globes. Histological analysis of heads from Salmon fry using 3.5 μm thick hematoxylin-eosin (HE) stained sections revealed no significant differences in tissue structure between exposed individuals and the control group, regardless of dose-rate. Extended storage on formalin did not have a negative effect on the outcome of HE-staining, and the tissue showed no apparent artefacts after dissection and dehydration. Prolonged fixation of salmon alevin did not impact the reactivity with immunofluorescent labels. Molecular effects were investigated by staining 3.5 μm paraffin sections with primary antibodies and a rhodamine red fluorescent secondary antibody. Autophagy in the eye was investigated by labeling with microtubule associated protein 1 light chain 3 (LC3), but the marker revealed no significant effect from radiation. Apoptosis and cell-proliferaion were investigated by labeling with Caspase-3, Ki-67 and Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) antibodies respectively, but none of the markers gave detectable levels, most likely due to incompatibility between the antibodies used and Salmo salar as a species. Fibrosis was investigated using α-Smooth Muscle Actin (α-SMA), and despite no visible fibrotic tissue in the eye, elevated levels of the enzyme was found as a response to doses above 10 mGy/h. Oxidative DNA damage was investigated by labeling with 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8OHdG), 8-oxoguanine-DNA glycosylase (OGG1), Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) and anti-DNA polymerase-β for detection of base excision repair (BER) activity. No persistent damage to nuclear DNA was found 3 months after exposure, although detection of cytoplasmic 8OHdG and APE1 suggests damage to mRNA and mitochondrial DNA (mtDNA) independent of dose. Slightly elevated levels of DNA-pol β in the nuclei could be seen in irradiated fish in a dose-dependent manner. Although clinical cataract was not directly assessed, mechanisms associated with developing cataracts were identified. Detection of markers for fibrotic tissue and oxidative damage in the lens and lens-epithelial cells (LECs) increased in a dose dependent manner after exposure to γ-radiation and may suggest a future development of cataracts.

Organismer er på sitt mest sårbare for ioniserende stråling i det embryonale livsstadiet, og øyet er et av de mest sensitive organene. Høy celleproliferasjon, celledifferensiering og embryonal utvikling er avhengig av intakt DNA og andre biomolekyler. I det nåværende studiet ble øyer fra atlantisk laks (Salmo salar) studert ved overgangen fra plommesekkyngel til yngel, etter en tre måneders restitueringsperiode fra eksponering med γ-stråling ved doseratene 1, 10 og 20 mGy/h under den embryonale utviklingen. Langtidseffekter på utvikling av øyet ble vurdert gjennom histologiske metoder, og molekylære responser ble undersøkt gjennom immunfluorescens. I tillegg ble effekter knyttet til ioniserende stråling og utvikling av katarakt undersøkt ved bruk av molekylære markører. Hele øyne fra ikke-bestrålte lakse-parr ble også dissekert og undersøkt for dokumentasjon av mulige effekter forbundet med formalin-fiksering og implikasjonene for histokjemisk analyse av øye-globen. Histologisk undersøkelse av hoder fra lakseyngel ved bruk av 3,5 μm tykke haematoxylin-eosine (HE) fargede snitt avslørte ingen signifikante forskjeller i vevsstrukturer mellom eksponerte individer og kontrollgruppen, uavhengig av doserate. Lang lagring på formalin hadde ingen negativ effekt på utfallet av HE-fargningen, og vevet viste ingen åpenbare artefakter etter disseksjon og dehydrering. Forlenget fiksering av lakseyngel hadde heller ingen effekt på reaktiviteten til immunfluoriserende markører. Molekylære effekter ble undersøkt ved å farge 3,5 μm tykke parafinsnitt med primære antistoffer og et rhodamin-rødt fluoriserende sekundært antistoff. Autofagi i øyet ble undersøkt ved merking med mikrotubuli-assosiert protein lettkjede 3 (LC3), men markøren viste ingen signifikant effekt fra stråling. Apoptose og celleproliferasjon ble undersøkt med henholdsvis caspase-3, Ki-67 og antiprolifererende nukleært antigen (PCNA), men ingen av markørene viste sporbare nivåer, mest sannsynlig et resultat av manglende kompatibilitet mellom antistoff og Salmo salar som art. Fibrose ble undersøkt med α-glatt muskel aktin (α-SMA), og økte nivåer av enzymet ble funnet som et resultat av stråling til tross for at fibrose ikke ble observert. Oksidativ DNA-skade ble undersøkt ved å merke prøvene med henholdsvis 8-hydroxy-2’-deoxyguanosie (8OHdG), 8-oxoguanin-DNA glykosylase (OGG1), Apurinisk/apyrimidinsk endonuklease 1 (APE1) og anti-DNA-polymerase β (DNA-pol β) for deteksjon av base-eksisjons-reparasjon (BER) aktivitet. Ingen persistent skade i nukleært DNA ble funnet 3 måneder etter eksponering, men deteksjon av cytoplasmisk 8OHdG og APE1 indikerer skade på mRNA og mitokondrielt DNA (mtDNA) uavhengig av stråledose. Noe forhøyde nivåer av DNA-pol β i cellekjernen kunne observeres i et dose-avhengig forhold i eksponert fisk. Selv om klinisk katarakt ikke ble vurdert direkte, ble mekanismer forbundet med utvikling av katarakt identifisert. Deteksjon av markører for fibrose og oksidativ skade i linsen og linses epitelceller (LECs) økte på en doseavhengig måte etter eksponering med γ-stråling, og kan indikere en fremtidig utvikling av katarakt.