CRISPR based functional characterization of the abcg2b gene contribution to muscle pigmentation in Atlantic salmon

Abstract

Red flesh coloration is an important trademark of salmon meat and commonly associated with its quality. The colour intensity is largely controlled by diet composition and mainly caused by the red pigment astaxanthin, which is absorbed from the feed in the mid-gut and transported via the blood to the muscles. The pigment islipid soluble and tightly linked to lipid transport. However, flesh coloration is under genetic control as well, and represents an important trait in salmon breeding programs. As part of the ongoing GENEinnovate project, Atlantic salmon CRISPR-Cas9 mediated knockouts (KO) of three different genes were performed. One of these genes, abcg2b, is the main subject of this thesis. The activity of abcg2b is known to impact Atlantic salmon flesh coloration negatively. However, the exact functional role of abcg2b in connection to salmon flesh coloration is unknown. As abcg2b produces a membrane transporter, it is hypothesized to export astaxanthin from the enterocytes of mid-gut villi back to the intestinal lumen. In this thesis we compare the lipid content of mid-intestine villi from abcg2b knockout salmon and wild type salmon using fluorescent microscopy. The images show a clear increase in lipid content in abcg2b knockout salmon villi compared to wild type salmon villi of the same age. The average lipid coverage, as well as the normalized number of droplets, was more than twice as high in knockout salmon villi as in control salmon villi. This supports the hypothesis that abcg2b exports lipids from the enterocyte back to the intestinal lumen. Astaxanthin is likely cotransported with lipids by abcg2b, leading to lower astaxanthin blood levels and a paler flesh coloration in salmon with high abcg2b activity. This thesis also tested the getPCR method to estimate editing (KO) efficiency in mosaic F0 salmon. The method uses a modified version of qPCR to calculate KO efficiency relatively to an internal and external control. Eight salmon carrying gene edits of either abcg2b or bco1-like were tested using the same getPCR reaction. The resulting KO efficiency was then compared to a KO efficiency estimated with the “gold standard” method of deep sequencing. The comparison shows that getPCR estimations correlate with the estimations produced by the sequencing-based method, but also that getPCR is vulnerable to PCR inhibiting contaminants. The getPCR method works best on high-knockout individuals and could be used as a fast and cost-efficient way to screen large numbers of fish and select the individuals with highest KO efficiency for further evaluation. It is currently not accurate enough to replace sequencing-based KO efficiency estimation. However, it could be a less invasive, fast an cost-effective alternative to visual marker-gene assisted KO efficency estimation.

Den røde kjøttfargen til laks er et viktig varemerke og ofte forbundet med kvaliteten av fileten. Fargeintensiteten styres i stor grad av kostholdssammensetninger og skyldes hovedsakelig det røde pigmentet astaxanthin, som absorberes fra fôret i midt-tarmen og transporteres via blodet til muskelen. Pigmentet er lipidløselig og tett knyttet til lipidtransport. Kjøttfarging er inmidlertid også under genetisk kontroll og representerer en vikit faktor i lakseavlsprogrammer. Som en del av det pågående GENEinnovate-prosjektet ble CRISPR-Cas9-formidlede knockouts av tre forskjellige gener i Atlantisk laks utført. Ett av disse genene, abcg2b, er hovedfokuset i denne oppgaven. Aktiviteten til abcg2b er kjent for å påvirke kjøttfargen i Atlantisk laks negativt. Den nøyaktige funksjonelle rollen abcg2b har i forbindelse med laksekjøttfarging er imdlertid ukjent. Ettersom abcg2b produserer en membrantransportør er forventningen at proteinet eksporterer astaxanthin fra enterocytter i midttarmen tilbake til tarmlumen. I denne oppgaven sammenligner vi lipidinnholdet i midt-tarm enterocytter fra abcg2b knockout-laks og villtype-laks ved hjelp av fluorescens-mikroskopi. Bildene viser en klar økning i lipidinnhold i abcg2b knockout tarmtotter sammenlignet med tarmtotter fra villtype-laks i samme alder. Gjennomsnittlig lipiddekning og normalisert antall lipid-dråper var mer enn dobbelt så høyt i knockout tarmtotter enn i villtypen. Dette styrker hypotesen om at abcg2b eksporterer lipider fra enterocytten tilbake til tarmlumen. Astaxanthin transporteres sannsynligvis sammen med lipider av abcg2b, noe som fører til lavere konsentrasjon av astaxanthin i blodet og en lysere kjøttfarging hos laks med høy abcg2b-aktivitet. Denne oppgaven testet også getPCR-metoden for å estimere genredigerings-effektivitet (KOeffektivitet) i mosaikk F0 laks. Metoden bruker en modifisert versjon av qPCR for å beregne KOeffektiviteten relativt til en intern og ekstern kontroll. Åtte laks som var genredigert i enten abcg2b eller bco1-like ble testet ved hjelp av samme getPCR-reaksjon. Den resulterende KO-effektiviteten ble deretter sammenlignet med en KO-effektivitet estimert ved hjelp av ”gull-standarden” dyp sekvensering. Sammenligningen viser at det er korrelasjon mellom det getPCR-baserte estimatet og det sekvenseringsbaserte estimatet, men også at getPCR er sårbar for PCR-hemmende forurensninger. getPCR-metoden fungerer best på individer med høy KO-effektivitet. Den kan brukes som en rask og kostnadseffektiv måte for å undersøke et stort antall fisk og velge ut individer med høyest KOeffektivitet for videre evaluering. Metoden er foreløpig ikke nøyaktig nok til å erstatte sekvensbasert KO-effektivitetsestimering. getPCR kan derimot være et mindre risikofylt, raskt og kostnadseffektivt alternativ til KO-effektivitetsestimering via et visuelt markør-gen.