Characterization and optimization of the ParB_INT imaging tool

Abstract

Partitioning B (ParB) proteins are key to the prokaryotic partitioning machinery which ensures proper segregation of replicated plasmid DNA strands. ParB proteins bind specifically to a centromere-like parS sequence, from which dimerized partition complexes distribute to flanking regions over several kbp in a mechanism termed spreading. These proteins and parS sequence have been repurposed for the ParB_INT imaging system to visualize single gene loci in living cells by Bystricky and colleagues. By integrating a relatively short parS sequence close to a sequence of interest and ectopically expressing a fluorescent ParB protein, the spreading of ParB upstream and downstream on the DNA creates a visible spot for the locus detectable by light microscopy.

ParB proteins may possess nuclease activity, which could have a negative impact on the genomic region when ParB spreads over parS and neighboring sequences. We have predicted the structure of ParB proteins and performed an evolutionary analysis of ParB proteins. We suggest that the nuclease activity is likely located to the two highly conserved regions, BOX I and BOX II.

I constructed 15 different ParB clones. Different ParB3 proteins were tested for nuclease activity: the original prokaryotic protein, a humanized version, and a truncated core domain. I also show that the original prokaryotic protein and the humanized version may possess nuclease activity, whereas the structural core domain of ParB3 does not exhibit the same activity in the presence of plasmid DNA. The results from the nuclease assay need further validation after improvement of the recombinant purification protocol. Moreover, we found that the humanized ParB protein did not improve the ParB-INT imaging system in OS25 cells.

Partisjoneringsprotein B (ParB) er et nøkkelprotein for bakteriers evne til å segregere replikerte plasmider til cellepolene under celledeling. ParB-proteiner binder til en sentromerliknende parS-sekvens. Fra denne sekvensen distribueres dimeriserte ParB-proteiner i begge retninger over flere kbp. Denne «sprednings»-mekanismen har blitt utnyttet som et verktøy til å visualisere enkelt genlokus in levende celler av Bystricky og kollegaer. Ved å integrere den kilobaser-lange parS -sekvensen i nærheten av en sekvens av interesse, og ektopisk uttrykke et fluoriserende ParB-protein, vil ParB koblet til et fluoriserende protein gjøre lokuset synlig gjennom lysmikroskopi. Tidligere studier har beskrevet ParB som en nuklease, noe som kan ha negative innvirkninger på genomisk DNA i cellen når ParB binder seg til de integrerte parS-sekvensene. Vi har i denne studien predikert strukturen til ParB-proteiner og utført en evolusjonær analyse av ParB-homologer, hvor vi observerte at nuklease-aktiviteten til proteinet kan tilegnes aminosyrer som befinner seg i to svært konserverte områder, BOX I og BOX II. Disse områdene kan benyttes til videre mutasjonsstudier. Jeg konstruerte 15 forskjellige ParB-kloner. Ulike ParB3-proteiner ble undersøkt for nuklease-aktivitet: det originale prokaryote proteinet, en humanisert versjon og et protein bestående av kjernedomenet. Jeg detekterte nuklease-aktivitet hos både det originale prokaryote proteinet og den humaniserte versjonen. Derimot virker ikke kjernedomenet til å uttrykke liknende aktivitet med plasmid-DNA tilstede. Nuklease-analysen krever flere underbyggende analyser for å bekrefte resultatene, etter en forbedret protokoll for opprensing er utarbeidet. Videre så vi ingen forskjell på humanisert og prokaryot versjon av ParB3 ved visualisering i stamceller fra museembryo med en integrert parS sekvens.