Vis enkel innførsel

dc.contributor.advisorVåge, Dag Inge
dc.contributor.advisorPandey, Deo Prakash
dc.contributor.authorBerg, Sigrid Karlsen
dc.date.accessioned2020-10-05T14:21:28Z
dc.date.available2020-10-05T14:21:28Z
dc.date.issued2020
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/11250/2681213
dc.description.abstractProper gene expression relies on control by an abundant number of factors and mechanisms, and the orchestration of these fine-tuned programs is fundamental in cellular functionality. Transcription regulation by RNA polymerase II (RNA Pol II) carboxy-terminal domain (CTD) phosphorylation influence global transcription levels and manufacture the adjustment of final RNA products. Several kinases have been reported to be involved in regulation of these intracellular regulatory pathways by phosphorylation of Pol II CTD, and their functional disturbance is linked transcription mis-regulation and disease. Two of the kinases described are cyclin-dependent kinase 12 (CDK12) and CDK13. Research suggests for a role of CDK12 in phosphorylating CTD Serine 2 (Ser2) for productive elongation, while the evidence of CDK13 in its role as a CTD kinase is undefined. They both appear to possess roles in maintenance of genomic stability, but their exact roles are far from established. We here aimed to elucidate the roles of chromatin-bound CDK12 and CDK13 expressed at endogenous levels. From technical causes, CDK13 was excluded from further analyses. This study consequently focused on CDK12 as a CTD Ser2 and Ser5 kinase. Moreover, we aimed to identify the interactome of chromatin-bound CDK12 to acquire knowledge on its role in transcription and RNA processing events. Heat shock treatment of cells was used as a tool to disturb RNA pol II transcriptional programs, and THZ531 was used to inhibit CDK12/13 catalytic activity. Immunofluorescent analyses reveled changed distribution patterns of RNA Pol II and CDK12-GFP upon heat shock- and THZ531 treatment. CTD Ser2 phosphorylation levels decreased under both treatment methods. Obtained results of CTD Ser5 phosphorylation levels were diverging, hence undecidable. Moreover, mass spectrometry (MS) combined with western blot analyses revealed CDK12 to dissociate from chromatin after 30 minutes heat shock treatment. Bioinformatic analyses of the MS data further revealed mRNA processing to be among the most enriched functional groups of CDK12-GFP bound proteome under non-heat shock conditions. RNA splicing- and transcription regulatory factors, and proteins involved in the mRNA surveillance pathway were among the most enriched terms. Together, our data support previous research demonstrating a decrease in Ser2 phosphorylation state upon CDK12/13 inhibition, as well as CDK12 to be a factor involved in transcription and RNA processing events.en_US
dc.description.abstractKorrekt genekspresjon er avhengig av et stort antall faktorer, og en finjusert balanse av deres mekansimer er avgjørende for cellens funksjon. Transkripsjonsregulering ved RNA Pol II CTD fosforylering påvirker transkripsjon på et globalt nivå og justerer endelig nivå av cellens RNA produkt. Tidligere forskning hevder at flere proteiner, såkalte kinaser, er involvert i transkripsjonsregulering ved fosforylering av Pol II CTD, og svekket funksjonalitet av disse proteinene er knyttet til feilregulering av transkripsjon, og eventuell påfølgende sykdom. To av kinasene som er beskrevet er CDK12 og CDK13. Tidligere studier hevder at CDK12 fosforyliserer CTD Ser2 for å fremme produktiv elongering, mens CDK13 i sin rolle som CTD kinase fortsatt er udefinert. De ser begge ut til å være essensielle for å opprettholde genomisk stabilitet, men deres eksakte roller er til dags dato ikke etablert. Målet med denne oppgaven var å belyse endogent uttrykt CDK12 og CDK13 i sine roller som kromatin-bundne CTD kinaser. CDK13 ble etter tekniske årsaker ekskludert fra videre analyser. Denne studien fokuserte som følger på CDK12 som CTD Ser2 og Ser5 kinase. Videre var målet å identifisere proteiner som naturlig interagerer med kromatin-bundet CDK12 for å oppnå kunnskap om dette proteinets rolle i transkripsjon og RNA-prosessering. Varmebehandling av celler ble brukt som et verktøy for å forstyrre RNA Pol II under transkripsjonen, og THZ531 ble brukt for å forstyrre CDK12/13 katalytisk aktivitet. Immunofluorescerende analyser avslørte endrede fordelingsmønster av RNA Pol II og CDK12-GFP som følger av varme- og THZ531 behandling. Fluorescerende nivåer av CTD Ser2 sank under begge behandlingsmetodene, mens nivåene av CTD Ser5 var tvetydige. MS kombinert med western blot analyse avslørte at CDK12 frigjøres fra kromatin etter 30 minutter med varmebehandling. Bioinformatiske analyser demonstrerte videre at mRNA-prosesserende faktorer var blant de største funksjonelle gruppene som under normale forhold er bundet til CDK12-GPP. Faktorer involvert i RNA spleising- og transkripsjonsregulering, samt i kvalitetskontroll av mRNA, var blant de mest interessante funnene. Våre data støtter tidligere forskning som viser en nedgang i CTD Ser2 fosfoyleringsnivå etter CDK12/13-inhibering, samt at CDK12 er involvert i transkripsjon og prosessering av RNA.en_US
dc.language.isoengen_US
dc.publisherNorwegian University of Life Sciences, Åsen_US
dc.rightsAttribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internasjonal*
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/deed.no*
dc.titleCharacterization of chromatin-bound interactome of cyclin-dependent kinase 12 (CDK12)en_US
dc.typeMaster thesisen_US
dc.source.pagenumber102en_US
dc.description.localcodeM-BIOTEKen_US


Tilhørende fil(er)

Thumbnail

Denne innførselen finnes i følgende samling(er)

Vis enkel innførsel

Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internasjonal
Med mindre annet er angitt, så er denne innførselen lisensiert som Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internasjonal