Molecular studies of Atlantic cod (Gadus morhua) globin genes – functional effects of hemoglobin polymorphisms and their geographical distribution

Abstract

The phenotypic variation among Atlantic cod hemoglobins and their physiological properties has been of great interest to researchers for several decades, and many cod stocks have been “genotyped” according to the HbI nomenclature established by Knud Sick in 1961, stating that the HbI-1 and HbI-2 variants are related to warm and cold waters, respectively. Paper I unambiguously connects the HbI phenotypes to the two haplotypic variants Met55-Lys62 and Val55-Ala62 of the polymorphic β1-globin gene. From three dimensional (3D) modeling of tetrameric α1β1α1β1 hemoglobin, we proposed that the polymorphisms at β1-55 and β1-62 are related to variable O2 affinity and variation in temperature sensitivity, respectively. To haplotype these loci efficiently, a High Resolution Melting (HRM) assay was developed (Paper IV). Multiple variants, including recombinations between the β1-55 and β1-62 loci, were identified in trans-Atlantic populations. The intergenic promoter of the head-to-head organized α1-β1 genes were shown to display an indel polymorphism of 73 bp strongly linked to the β1-55 and β1-62 polymorphisms (Paper III). Comparison of transcriptional activity revealed that the longer β1-Val55-Ala62- linked promoter, mostly found in colder waters, generated twice the activity of the short one at temperatures of 15 and 20 °C. The increased activity at elevated temperatures is suggested to be a compensatory mechanism to counterbalance the low O2 affinity at high temperatures of the β1-Val55-Ala62 haplotype by increasing the Hb-β1 concentration in erythrocytes. Studies of the draft genome sequence of Atlantic cod showed that it harbors two unlinked globin clusters which host β5-α1-β1-α4 and β3-β4-α2-α3-β2, respectively (Paper II). Expression analyses confirmed that several of the genes are mainly expressed during embryo development, putatively serving immunological functions, whilst α1, α2, β1 and β2 contributed polypeptides constituting the adult hemoglobins. The clusters are flanked by genes conserved in other genome-sequenced teleosts, and some flanking genes are also found in extant urochordate and cephalochordate species, linked or not to globins, leading to speculations about the origin of the ancestral vertebrate globin cluster.

Fenotypisk variasjon mellom hemoglobin (Hb) varianter hos Atlantisk torsk og deres fysiologiske egenskaper, har vært av stor interesse for mange forskere i flere tiår, og mange torskestammer er ”genotypet” i henhold til HbI nomenklaturen som ble etablert av Knud Sick i 1961, og som stadfester at HbI-1 og HbI-2 variantene henholdsvis er assosiert med varmt og kaldt vann. Artikkel I relaterer HbI fenotypene direkte til de to haplotypene Met55Val og Lys62Ala i det polymorfe β1-globingenet. Basert på tredimensjonal (3D) modellering av hemoglobin α1β1α1β1 tetramerer foreslo vi at polymorfiene ved β1-55 og β1-62 er forbundet med henholdsvis økt O2 affinitet og redusert temperatursensitivitet. For å kunne genotype disse to loci effektivt, ble det utviklet et ”High Resolution Melting” (HRM) assay (Artikkel IV). Multiple varianter, inkludert rekombinanter mellom β1-55 og β1-62, ble avdekket i trans-Atlantiske populasjoner. Det ble identifisert en 73 bp stor indel polymorfi i den intergeniske promoteren til de hode-mot- hode (5’-5’) organiserte α1-β1 genene, som er sterkt koblet til β1-55 og β1-62 polymorfiene (Artikkel III). Sammenligning av transkripsjonsaktiviteten viste at den lange promotoren, assosiert til β1-Val55-Ala62 allelet og kalde omgivelser, hadde mer enn dobbelt sa høy aktivitet som den korte ved temperaturer på 15 and 20 °C. Den økte aktiviteten ved høye temperaturer antas å kunne være mekanisme som utligner og kompenserer for at β1-Val55-Ala62 allelet har dårlig O2 affinitet ved høye temperaturer, ved å øke konsentrasjonen av Hb-β1 i erytrocyttene. Studier av foreløpig genomsekvens fra Atlantisk torsk viste at genomet har to ikke-koblede globin-clustere som henholdsvis inneholder β5-α1-β1-α4 og β3-β4-α2-α3-β2 (Artikkel II). Ekspresjonsanalyser viste at flere av globinene hovedsakelig uttrykkes under embryogenesen kanskje som et bidrag til immunforsvaret, mens α1, α2, β1 og β2 genene bidro med globin peptider til hemoglobin hos voksen fisk. Clusterne er flankert av gener som er konservert i andre genomsekvenserte teleoster, og noen flankerende gener er også påvist i nålevende urochordat- og cephalochordatarter, både koblet og ikke koblet til globiner, som legger grunnlag for spekulasjoner omkring dannelsen av det opprinnelige vertebrat globin clusteret.