The roles of conserved second sphere residues in lytic polysaccharide monooxygenase catalysis
Master thesis
![Thumbnail](/nmbu-xmlui/bitstream/handle/11250/3029157/Mollatt2022.pdf.jpg?sequence=6&isAllowed=y)
View/ Open
Date
2022Metadata
Show full item recordCollections
- Master's theses (KBM) [927]
Abstract
The demand for sustainable and renewable options to generate energy and materials is increasing as we become more aware of the environmental impact of a petroleum-based economy. Biomass may be employed as a sustainable alternative and consists of recalcitrant polysaccharides. Key enzymes for disruption of crystalline polysaccharides, such as cellulose and chitin, are lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs). LPMOs are copper-dependent enzymes, and the catalytic mechanism is initiated by a reduction of the copper atom, coordinated in a histidine brace. Other residues in the catalytic center, termed second sphere residues, are not extensively studied but are likely involved in the catalytic mechanism resulting in oxidative cleavage of glycosidic bonds. Insight into how these residues affect LPMO activity may yield valuable information for optimization of polysaccharide degradation. Therefore, we aimed to investigate the interactions between and function of three second sphere residues (YQH) in cellulose-active MaLPMO10B. The second sphere motif of MaLPMO10B WT was mutated into the second sphere motif (FER) found in two other cellulose-active LPMOs; mgLPMO10 and ScLPMO10C. Each MaLPMO10B protein was assigned an amino acid code corresponding to the second sphere residues of the respective protein, e.g., YQH for MaLPMO10B wild type (WT).
Eight MaLPMO10B mutant proteins were generated, and several enzyme characterization assays were performed to compare the effect of the mutations with MaLPMO10B WT. All MaLPMO10B mutants displayed lower activity towards cellulose than MaLPMO10B WT. The YEH mutant displayed higher activity towards chitin than MaLPMO10B WT. This mutant also had a faster rate of oxidized cello-oligosaccharide formation and an increased generation of hydrogen peroxide in situ. The two other single mutants, YQR and FQH, displayed a slow rate for production of oxidized cello-oligosaccharides and a low oxidase activity but remained stable throughout the reaction time. The three double mutants inactivated prematurely, and the FEH mutant had a slow rate of oxidized product formation, whereas the rate at which the YER and the FQR mutants generated oxidized cello-oligosaccharides was fast. Both mutants with an FER second sphere motif appeared less stable upon oxidized product formation. Differences in oxidase activity were observed between the two FER mutants, mgLPMO10, and ScLPMO10C, that have FER as their natural second sphere motif. The second aim of this thesis was to study the effect of changing pH and type of reductant on the activity of MaLPMO10B WT and the YEH mutant. The rate of oxidized cellooligosaccharide formation increased from pH 6 to pH 8 when ascorbic acid or gallic acid were used as reductants. The opposite was observed when the reductant was cysteine. MaLPMO10B WT appeared to withstand changes in pH better than the YEH mutant, which showed optimal activity at pH 6.
In this thesis, we show that the second sphere residues are essential for LPMO activity, and that pH and type of reductant used have a significant impact on the efficiency of LPMO catalysis. Moreover, we demonstrate that a glutamine to glutamate mutation in the presence of a tyrosine residue (YE) instead of a phenylalanine residue (FE) significantly improves in situ production of hydrogen peroxide. This knowledge is important to optimize LPMO activity for industrial applications. Bærekraftige og fornybare alternativer for å skape energi og materialer øker i etterspørsel ettersom vi blir mer oppmerksomme på miljøeffekten av en petroleumsbasert økonomi. Biomasse kan fungere som et bærekraftig alternativ og består av svært hardføre polysakkarider. Nøkkelenzymer for å bryte opp krystallinske polysakkarider, som cellulose og kitin, er lytisk polysakkarid monooksygenaser (LPMOer). LPMOer er kobber-avhengige enzymer, og den katalytiske mekanismen blir initiert ved reduksjon av kobberatomet som er koordinert av to histidiner. Andre aminosyrer i det aktive setet, andresfære residuer, har ikke blitt forsket mye på, men er mest sannsynlig involvert i den katalytiske mekanismen som resulterer i oksidativ spalting av glykosidbindinger. Innsikt om hvilken effekt disse aminosyrene har på LPMO aktivitet kan gi verdifull informasjon for optimalisering av polysakkarid nedbrytning. Målet vårt var derfor å studere hvordan andresfære residuene (YQH) i celluloseaktive MaLPMO10B fungerer og interagerer med hverandre. Andresfære motivet i MaLPMO10B villtype (WT) ble mutert til andresfære motivet (FER) som finnes i to andre celluloseaktive LPMOer; mgLPMO10 og ScLPMO10C. Hvert MaLPMO10B protein fikk tildelt en aminosyrekode som korresponderer til andresfære residuene i det respektive proteinet, for eksempel YQH for MaLPMO10B villtype (WT).
Flere enzymatiske karakteriseringsanalyser ble utført for å sammenlikne effekten av mutasjonene med MaLPMO10B WT. Alle MaLPMO10B mutantene viste lavere aktivitet for cellulose enn MaLPMO10B WT. YEH mutanten viste høyere aktivitet for kitin enn MaLPMO10B WT. Denne mutanten produserte også oksiderte cellulose oligosakkarider raskere og genereringen av hydrogenperoksid in situ økte. De to andre enkeltmutantene, YQR og FQH, dannet oksiderte cellulose oligosakkarider sakte og hadde lav produksjon av hydrogenperoksid, men var stabile gjennom hele reaksjonstiden. De tre dobbelmutantene ble inaktivert før reaksjonstiden var omme, og FEH mutanten genererte oksiderte cellulose oligosakkarider sakte, mens YER og FQR mutantene dannet oksiderte cellulose oligosakkarider raskt. Begge mutantene som hadde et FER andresfære motiv virket å være mindre stabile under produktdannelse. Forskjeller i oksidaseaktivitet ble observert mellom de to mutantene med FER motiv, mgLPMO10, og ScLPMO10C som har FER som deres naturlige andresfære motiv.
Det andre målet for denne mastergradsavhandlingen var å studere effekten endring av pH og type reduktant hadde på aktiviteten til MaLPMO10B WT og YEH mutanten. Fra pH 6 til pH 8 økte hastigheten for generering av cellulose oligosakkarider når askorbinsyre og gallussyre ble brukt som reduktanter. Det motsatte ble observert når cystein ble brukt som reduktant. MaLPMO10B WT virket å motstå endringer i pH bedre enn YEH mutanten, som viste optimal aktivitet ved pH 6.
I denne mastergradsavhandlingen viser vi at andresfære residuene er essensielle for LPMO aktivitet, og at pH og type reduktant som blir brukt har en signifikant påvirkning på effektiviteten i LPMO katalyse. Vi viser også at en glutamin til glutamat mutasjon sammen med en tyrosin (YE) i stedet for en fenylalanin (FE) gir en signifikant økning av in situ produksjon av hydrogenperoksid. Denne kunnskapen er viktig for å optimalisere LPMO aktivitet i industrielle applikasjoner.