Det heterologe promotersystemet ComRS i Streptococcus pneumoniae : videreutvikling av systemet og sammenligning med Zn2+-systemet
Abstract
Streptococcus pneumoniae er en bakterie som kan forårsake flere sykdommer, og det har blitt observert økende antibiotikaresistens blant pneumokokker. Essensielle gener, altså gener bakterien er avhengig av for fullstendig cellefunksjon og overlevelse, utgjør potensielle mål for antibiotika. Dette gjør studier av essensielle gener viktig. Essensielle gener er vist å være vanskelig å studere, siden man ikke kan se konsekvensene av mangel på genproduktet før cellene dør. Dette er gjort mulig ved å uttrykke et essensielt gen ektopisk fra en regulerbar promoter ved hjelp av en induser, noe som muliggjør delesjon av det native genet. Slik kan man manipulere uttrykket av genet ved tilsetting av induser, og overuttrykke eller deplete genet. Slik kan man se hvordan bakterien påvirkes, og få en ide om hvilke prosesser det essensielle genproduktet er involvert i. ComRS-systemet induseres av peptidet ComS, som aktiverer transkripsjonsregulatoren ComR som videre regulerer transkripsjon av gener fra promoteren PcomX. Ved å sette inn et ønsket essensielt gen bak PcomX, og skru av den native varianten av genet, kan man ved tilsetting av ønsket konsentrasjon av ComS kontrollere uttrykket av genet bak PcomX. Et annet system mye brukt system er Zn2+-systemet. Her kan man regulere uttrykket av gener fra promoteren PczcD ved å tilsette Zn2+ til vekstmediet.
I dette arbeidet ble 15 modifiserte peptider (S1-S15) syntetisert med utgangspunkt i ComS*. Hensikten var å se om en av disse hadde andre ønskede egenskaper enn ComS*. Testede egenskaper var bl.a. maksimums induksjon, hvor høy eller lav konsentrasjon av peptider som trengtes og hvor raskt peptidet ble degradert i cellen. Luciferase reporterassay viste at et peptid S1, induserte til høyere luciferaseaktivitet ved lavere konsentrasjoner enn ComS*. Luciferase reporterassay og depletion-forsøk viste at peptidene S4 og S6 ga raskere nedgang luciferaseaktivitet og raskere depletion. Noe som er fordelaktig for å få en rask effekt av fraværet av et genprodukt. Dermed kan man anta at S4 og S6 degraderes raskere i cellen enn ComS*. I tillegg ble det nyetablerte ComRS-systemet sammenlignet med det veletablerte Zn2+-systemet i S. pneumoniae. Deres evne til å kontrollere genuttrykk, og til å deplete et essensielt gen ble undersøkt. Luciferase reporterassay og depletion-forsøk viste at ComRS-systemet er best egnet til overuttrykkelse av et gen. En viktig grunn til dette er at høye konsentrasjoner av Zn2+ har negative effekter på cellen. Zn2+-systemet gir derimot noe raskere depletion. En mulig forklaring kan være at Zn2+ inngår i flere cellefunksjoner og dermed raskere brukt opp av cellen. ComRS-systemet er også vist å egne seg godt til depletion. Totalt sett er det mindre usikkerhet ved bruk av ComRS-systemet, siden ComS* ikke har andre kjente virkninger i cellen enn induksjon.