Celleveggankring av Mycobacterium tuberculosis-antigener på overflaten til Lactobacillus plantarum
Master thesis
![Thumbnail](/nmbu-xmlui/bitstream/handle/11250/2673171/Berggreen2020.pdf.jpg?sequence=5&isAllowed=y)
View/ Open
Date
2020Metadata
Show full item recordCollections
- Master's theses (KBM) [927]
Abstract
Denne oppgaven er en del av et større forskningsprosjekt hvor det langsiktige målet er å utvikle en slimhinnevaksine mot tuberkulose, hvor melkesyrebakterier benyttes som leveringsvektor av antigener. Melkesyrebakterier er attraktive kandidater for leveringsvektor av vaksineantigener, da de anses som trygge å konsumere av mennesker, og noen hevdes å ha adjuvansegenskaper. Lactobacillus plantarum er spesielt interessant som leveringsvektor av antigener på grunn av sin evne til å overleve i mage-tarmkanalen i opp mot en uke. Ulike ankringsmetoder av antigen på celleoverflaten til L. plantarum har tidligere blitt benyttet, blant annet kovalent, C-terminalt LPxTG-celleveggankring. Tidligere bruk av celleveggankeret cwa2 for ankring av tuberkuloseantigener har gitt immunorespons i mus ved bruk som internasal boostervaksine av BCG. Cwa2 har derimot vist å hemme veksten til verten betydelig. Denne masteroppgaven beskriver studier der L. plantarum modifiseres til å produsere M. tuberculosis-antigen som ankres til celleoverflaten ved bruk av nye LPxTG celleveggankre, og studier som karakteriserer av de rekombinante bakteriene.
Det ble utført en in silico analyse av subcellulære proteiner i L. plantarum WCFS1, for å identifisere LPxTG celleveggankre. Basert på analysen ble syv celleveggankersekvenser med ulike egenskaper valgt. De valgte ankersekvensene ble fusjonert C-terminalt til hybridantigenet Ag85B-ESAT6. Det ble vist en generell hemming av veksten til de rekombinante L. plantarum med celleveggankret hybridantigen. Videre karakterisering ga indikasjoner på noe varierende grad av sekresjon og overflateankring av hybridantigenet, samt reduksjon i levedyktigheten til de ulike stammene med celleveggankre. Stammene med cellevegganker viste indikasjoner på varierende grad av stressrespons. Det ble funnet tegn på forskjeller i transkripsjonsnivået av hybridantigenet i stammene, men disse var ikke signifikante. Resultatet tyder på at variasjonen i stressnivå skyldes faktorer senere i prosessen, etter transkripsjon, som for eksempel translokasjon og ankring.
Ankersekvensen hentet fra genet lp_3001 viste mest lovende resultater, sammenlignet med det originale ankeret cwa2. Imidlertid viste analysene at alle de utvalgte celleveggankrene førte til betydelig stress for verten. Videre analyser for nærmere å identifisere årsaker til stress, og optimalisering av cellevegganker, er nødvendig før cellevegganker kan benyttes i en vaksine mot tuberkulose. This study is part of a lager research project where the long-term goal is to develop a mucosal vaccine against tuberculosis, with lactic acid bacteria (LAB) as delivery vectors of antigens. LAB are good candidates for this purpose, as they are regarded as safe to consume by humans and some are claimed to have adjuvant properties. Lactobacillus plantarum is perticalary interesting as delivery vectors of antigens because they can survive in the gastrointestinal tract for up to one week. Different methods of anchoring antigens to the surface of L. plantarum has been used before, among them C-terminal LPxTG cell wall anchors. A construct using the cell wall anchor cwa2 to anchor tuberculosis antigens has been shown to give an immune response in mouse when used as a booster vaccine to BCG. Cwa2 has been shown to significantly inhibit the growth of the host. This thesis describes studies where L. plantarum is modified to produce M. tuberculosis antigens anchored to the surface by new LPxTG cell wall anchors, and studies that characterise of the recombinant bacteria.
An in silico analysis of the subcellular proteins in L. plantarum WCFS1 was performed to identify LPxTG cell wall anchors. Based on the analysis seven cell wall anchors with different properties were elected. The chosen anchor sequences were then fused C-terminal to the hybrid antigen Ag85B-ESAT6. A general inhibition of growth was shown for the recombinant L. plantarum with cell wall anchored hybrid antigen. Further characterisation indicated some variation in the amount of hybrid antigen secreted and anchored to the surface, as well as a reduction in the viability of the different strains with cell wall anchors. The results indicate varying degrees of stress response in the strains. Signs of variation in transcription levels were found, but not significant. The results point to that variation in stress levels are due to steps later in the production process, for example translocation and anchoring of the hybrid antigen.
The anchor sequence from the lp_3001 gene showed most promise, compared to the original anchor cwa2. However, the analysis showed that use of the cell wall anchors all led to considerable stress for the host. Further research is required to identify the source of stress, and to optimise the cell wall anchors if the anchors are to be used in a vaccine against tuberculosis.