Full circle : genetics, biosynthesis, mode of action and resistance mechanisms of the bacteriocin garvicin ML
Doctoral thesis
Permanent lenke
http://hdl.handle.net/11250/2497626Utgivelsesdato
2013Metadata
Vis full innførselSamlinger
- Doctoral theses (KBM) [124]
Sammendrag
Bacteriocins are ribosomally synthesized antimicrobial peptides, produced by many lactic acid bacteria, which show high promise as antimicrobial agents for use in both food industry and for medical applications. In this work, we have studied the bacteriocin garvicin ML (GarML), which is a head-to-tail ligated circular bacteriocin that has a broad spectrum of activity and is active against a range of pathogenic bacteria. This class of bacteriocins is furthermore attracting interest due to their favourable characteristics for potential industrial use, i.e. high pH and thermal stability in addition to resistance to many proteases. However, there are many aspects of circular bacteriocin biology that are still not known, and in this work, we have attempted to shed light on the processes which govern the biosynthesis, mode of action and resistance to this bacteriocin.
Circular bacteriocins are synthesized with a leader sequence, and maturation of these peptides is thought to occur through three steps: cleavage of the leader sequence, head-to-tail circularization and export out of the cell. However, the mechanisms involved or indeed the enzymes responsible have not yet been characterized. Furthermore, the sequence of events and potential coupling of these processes is unknown. In paper I and II we have sequenced the producer strain of GarML, which allowed identification and characterization of the gene cluster involved in biosynthesis and immunity to GarML. The gene cluster was shown to share several traits, both in genetic organization and in the putative functions of the encoded proteins, with other circular bacteriocin gene clusters. Functional analysis combined with mass spectrometry of deletion mutants of the GarML operons revealed new insights into biosynthesis of GarML, which may thus apply to circular bacteriocins in general. Firstly, we have provided evidence for leader sequence cleavage occurring without subsequent circularization in two knock-out mutants (ΔgarBCDE and garX∷pCG47), which demonstrates not only that these processes are independent, but that leader sequence cleavage precedes circularization in time (paper II). Furthermore, the evidence suggests that leader sequence cleavage is not performed by any of the proteins encoded by the GarML gene cluster, i.e. garX, garBCDE or garFGH, because we still observe cleavage in their absence (paper II). Two of the operons, namely garX, garBCDE, were implicated in biosynthesis of GarML, specifically in the circularization reaction, as well as providing immunity towards GarML, while the third operon (garFGH) was demonstrated to be non-essential.
For circular bacteriocins it has been and remains a controversial issue whether these peptides require a target receptor or docking molecule like the class Ia lantibiotics and IIa pediocin-like bacteriocins for antimicrobial activity, or whether the peptides interact unspecifically with the target cell membrane to create pores. A few circular bacteriocins have been demonstrated to act on liposomes and/or lipid bilayers, which may indicate that a target receptor is not required, at least at high bacteriocin concentrations. In paper III we however provide evidence for a maltose ABC transporter being implicated in sensitivity to GarML in L. lactis. The deletion of this complex led to 6-11-fold lowered sensitivity to GarML, whereas complementation restored high-level sensitivity to the bacteriocin. However, consistent with other circular bacteriocins, we observe receptor-independent killing at higher concentrations of GarML. These results therefore suggest that this class of bacteriocins may indeed require a specific interaction with a target receptor/mediator for antimicrobial activity at low concentrations.
Resistance mechanisms to bacteriocins, both developed and innate, are poorly understood for many classes of bacteriocins. Gaining insight into these processes is essential in order to be able to minimize resistance, which is an important prerequisite for the potential use of bacteriocins in many applications. In this work, we have demonstrated examples of both adaptive and inherent resistance to GarML. In paper III, we have shown that L. lactis can develop resistance to GarML by loss of the maltose ABC transporter, which occurs at relatively low frequencies (from 10-7 to10-8) compared to adaptive response of class Ia lantibiotics and class IIa pediocin-like bacteriocins. However, no resistance development occurs at high bacteriocin concentrations (>250 BU mL-1), which indicates that killing is receptor-independent above this level (paper III). In paper IV, we have however provided evidence for an inherent resistance mechanism against GarML, which is conserved in a lineage of L. lactis ssp. cremoris strains. This mechanism appears to be specific for GarML, as it does not affect sensitivity towards other bacteriocins targeting lactococci, even including another circular bacteriocin (paper IV). Thus, we have evidence for a new, specific and inherent mechanism of resistance to GarML in this lineage of L. lactis ssp. cremoris strains, which contributes to the understanding of how dissemination of resistance factors leads to intraspecies variations in sensitivity to bacteriocins. Bakteriosiner er ribosomalt syntetiserte antimikrobielle peptider som blant annet produseres av mange melkesyrebakterier, og som har stort potensial som antimikrobielle forbindelser til bruk i matindustri og i medisinske applikasjoner. I dette arbeidet har vi studert bakteriosinet garvicin ML (GarML), som er et peptid med sirkulær peptidkjede med bredt aktivitetsspektrum og som er aktivt mot mange patogene bakterier. Denne klassen av bakteriosiner anses som interessante fordi de har egenskaper som gjør dem godt egnet til eventuelle industrielle formål, dette er blant annet høy pH- og temperaturstabilitet i tillegg til resistens mot en rekke proteaser. Det er allikevel flere aspekter ved sirkulære bakteriosiner som ikke er tilstrekkelig forstått, og i dette arbeidet har vi ønsket å undersøke nettopp de prosessene som bestemmer biosyntese, virkningsmekanisme og resistensmekanismer for dette bakteriosinet.
Sirkulære bakteriosiner syntetiseres med en ledersekvens, og modning av peptidene er antatt å omfatte tre steg: kløyving av ledersekvensen, sirkulering ved ligering av N- og C-terminus, og eksport ut av cellen. Imidlertid er mekanismene involvert og de ansvarlige enzymene ikke kjent. I tillegg er rekkefølgen av disse stegene, og de mulige koblingene mellom dem, ennå ukjent.
I artikkel I og II har vi sekvensert produsentstammen av GarML, som igjen tillot identifisering og karakterisering av gruppen av gener, bestående av fire operoner, som er involvert i biosyntese av og immunitet mot GarML. Denne gruppen av gener ble vist å ha mye til felles, både når det gjelder organisering og antatte funksjoner av de proteinene disse genene koder for, med tilsvarende gener for andre sirkulære bakteriosiner. Funksjonell analyse kombinert med massespektrometri ga ny innsikt i biosyntesen av GarML, som dermed kan gjelde også for sirkulære bakteriosiner generelt. Først og fremst har vi påvist at kløyving av ledersekvensen skjer uten sirkularisering i to knock-out mutanter (ΔgarBCDE and garX∷pCG47), noe som demonstrerer at disse to prosessene er uavhengige, men også at kløyving skjer forut for sirkularisering i tid (artikkel II). Videre viser resultatene at kløyving av ledersekvensen ikke utføres av noen av proteinene som er kodet for i GarML operonene, det vil si garX, garBCDE eller garFGH, fordi man observerer kløyving også uten deres tilstedeværelse (paper II). To av operonene i gruppen, garX og garBCDE, ble vist å være involvert i biosyntesen av GarML, spesifikt i sirkulariseringsreaksjonen, og samtidig gi immunitet mot GarML, mens et tredje operon (garFGH) ble vist å være ikke-essensielt.
Når det gjelder sirkulære bakteriosiner, så er det kontroversielt hvorvidt disse peptidene trenger en målreseptor eller et dokking-molekyl for antimikrobiell aktivitet som klasse Ia lantibiotika og IIa pediocin-liknende bakteriosiner eller om de interagerer uspesifikt med cellemembranen for å danne porer. I noen tilfeller har det blitt vist at sirkulære bakteriosiner virker på lipid bilag og/eller liposomer, noe som kan indikere at et målmolekyl ikke er nødvendig, i hvert fall ved høye konsentrasjoner av bakteriosin. I artikkel III viser vi derimot at en maltose ABC transporter medvirker til sensitivitet mot GarML i L. lactis. Delesjon av dette komplekset gav 6-11-ganger lavere sensitivitet til GarML, mens komplementering gjenopprettet høy sensitivitet til bakteriosinet. Allikevel ble det ved svært høye konsentrasjoner av bakteriosin observert reseptor-uavhengig dreping. Disse resultatene indikerer dermed at det ved lave konsentrasjoner av bakteriosin kan være nødvendig med en spesifikk interaksjon med et målmolekyl for antimikrobiell aktivitet også for denne klassen bakteriosiner.
Resistensmekanismer mot bakteriosiner, bade utviklede og iboende, er ikke godt forstått for mange klasser av bakteriosiner. Det å få innsikt i disse prosessene er essensielt for å kunne minimere nettopp resistensutvikling, noe som er en forutsetning for den potensielle utnyttelsen av bakteriosiner til ulike formål. I dette arbeidet har vi vist eksempler på både utviklet og iboende resistens til GarML. I artikkel III har vi vist at L. lactis kan utvikle resistens mot GarML ved tap av maltose ABC transporter komplekset, som skjer ved en relativt lav frekvens (fra 10-7 til10-8) sammenliknet med utviklet resistens for klasse Ia lantibiotika og klasse IIa pediocin-liknende bakteriosiner. I tillegg ble det ikke observert noen resistensutvikling ved høy konsentrasjon av bakteriosin (>250 BU mL-1), noe som indikerer at over dette nivået så er drepingen ikke reseptor-mediert. I artikkel IV har vi derimot påvist en iboende resistensmekanisme mot GarML som er konservert i en avstamming av L. lactis ssp. cremoris. Denne mekanismen ser ut til å være spesifikk for GarML, da den ikke påvirker sensitivitet mot andre bakteriosiner som virker mot laktokokker, bl.a. et annet sirkulært bakteriosin. Derav tyder resultatene på at vi har en ny, spesifikk og iboende resistensmekanisme mot GarML i denne avstammingen av L. lactis ssp. cremoris stammer, noe som bidrar til forståelsen av hvordan spredning av resistensfaktorer fører til variasjon i sensitivitet mot bakteriosiner innad i arter.