Processing of apurinic/apyrimidinic (AP) sites in mammalian cells
Master thesis
Permanent lenke
http://hdl.handle.net/11250/186438Utgivelsesdato
2012-09-12Metadata
Vis full innførselSamlinger
- Master's theses (KBM) [927]
Sammendrag
Abstract
The integrity of deoxyribonucleic acid (DNA) is continuously challenged by endogenous and exogenous DNA damaging agents. Mutagenic and cytotoxic apurinic/apyrimidinic (AP) sites are amongst the most frequently formed lesions in cellular DNA and their repair is essential for genomic stability. AP sites in humans are processed and repaired mainly through base excision repair (BER), which is known to be initiated either by an AP endonuclease 1 (APE1) that incises 5’ to the AP site or by bifunctional DNA that incise 3’ to the AP site.
In this study, the processing of AP sites in mammals was investigated by knockout mice models of endonuclease eight-like DNA glycosylases (Neil1,Neil2), as well as down-regulation of the bifuctional endonuclease three (NTH1) and tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 (TDP1) in human epithelial cervical carcinoma (HeLa) S3 cells. The roles of bifunctional DNA glycosylases NEIL1, NEIL2 and NTH1 in AP site processing, using mouse and human whole-cell extracts, were examined by biochemical activity assays. Another aim of this study was to investigate whether an APE1-independent repair pathway involving NTH1 and TDP1 exist in mammals, since a recent study demonstrated such a mechanism in Schizosaccharomyces pombe where Tdp1 were shown to work downstream of Nth1.
The results obtained in this study show that APE1 is responsible for the main incision activity, whereas the roles of NEIL1 and NEIL2 in AP site processing were demonstrated to be non-essential. The product of NTH1 incision was observed in both mice and HeLa S3 extracts, indicating that NTH1 is also involved in AP site processing, although to a lesser extent than APE1. Biochemical analysis using recombinant NTH1, also demonstrated poor ability to process an APE1-nicked DNA substrate compared to an intact AP site, indicating that NTH1 most likely work upstream of APE1, and do not compete with polymerase β downstream of APE1.
The product of NTH1 was shown to be further processed by not only APE1, but also by TDP1 in both HeLa S3 cells and mice extracts, indicating that TDP1 is capable of working downstream of NTH1 in an APE1-independent manner and thus may serve as a back-up for APE1 in the repair of AP site.
Sammendrag
Integriteten av deoksyribonukleinsyre (DNA) utfordres kontinuerlig av endogene og eksogene forbindelser. Mutagene og cytotoksiske apurinske/apyrimidinske (AP)-seter er blant de mest forekommende DNA-skadene og deres reparasjon er essensiell for genomisk stabilitet. AP-seter i humane celler blir prosessert og reparert hovedsakelig gjennom baseeksisjonsreparasjon (BER), som antas å bli initiert av enten AP-endonuklease 1 (APE1) som kutter 5’ til AP setet, eller av en bifunksjonell DNA-glykosylase som kutter 3’ til AP setet.
I dette studiet ble prosesseringen av AP seter i mammalske celler undersøkt ved bruk knockout musemodeller av endonuklease VIII-lik DNA-glykosylaser (Neil1,Neil2), samt
ved nedregulering av den bifunksjonell DNA-glykosylasen endonuclease three (NTH1) og tyrosyl-DNA fosfodiesterase 1 (TDP1) i human kreftcellelinje (HeLa S3). Rollen av NEIL1, NEIL2 og NTH1 i prosesseringen av AP-seter ble undersøkt ved hjelp av biokjemiske aktivitetsanalyser. En annen hensikt med dette studiet var å undersøke om en APE1-uavhengig reparasjonsmekanisme som involverer NTH1 og TDP1 finnes i mammalske celler. Bakgrunnen for dette var en studie som nylig demonstrerte en tilsvarende reparasjonsmekanisme i Schizosaccharomyces pombe som tyder på at Tdp1 fungerer nedstrøms for Nth1.
Resultatene fra dette studiet indikerer at APE1 er ansvarlig for mesteparten av kutteaktiviteten av AP seter, mens bidraget av NEIL1 og NEIL2 i AP-sete reparasjon, har mest sannsynlig ingen essensiell betydning i mammalske celler. Produktet av NTH1 aktiviteten ble også observert i både muse og HeLa S3 ekstrakter, noe som tyder på at NTH1 er involvert i AP-sete reparasjon, men i noe mindre grad enn APE1. Rekombinant NTH1 demonstrerte dårligere evne til å prosessere et APE1-kuttet DNA substrat enn et intakt AP-sete. Dette tyder på at NTH1 mest sannsynlig virker oppstrøms for APE1, og konkurrerer ikke med polymerase β nedstrøms for APE1.
Produktet generert av NTH1, ble videre prosessert av ikke bare APE1, men også av TDP1 i både muse og HeLa S3 ekstrakter. Dette kan tyde på at TDP1 er i stand til å fungere nedstrøms for NTH1 på en APE1-uavhengig måte og kan derfor muligens fungere som en reserve for APE1 under AP-sete reparasjon.