Autochthonous lactic acid bacteria for plant-based food fermentation : potential, properties and application

Abstract

A diet rich in plant foods, such as cereals and pulses, provides a sustainable and nutritious alternative to animal protein. While these foods are incomplete protein sources, they provide a complementary profile of essential amino acids (EAA) when consumed together, ensuring a high-quality protein intake. The increased interest in plant-based foods has brought attention to their content of anti-nutritional factors (ANF) like raffinose, phytic acid, vicine, and convicine. Appropriate methods to improve the characteristics of these raw materials are needed to facilitate the development of nutritious, appealing and sustainable products. With the right microorganisms, fermentation has the potential to improve the nutritional value and organoleptic properties of plant-based foods. It has been suggested that the naturally occurring microorganisms in raw materials may provide suitable starter culture candidates for this purpose. This work aimed to characterise and evaluate autochthonous starter cultures composed of lactic acid bacteria (LAB) isolated from spontaneous fermentations of faba beans, peas, wheat and oat flours, to improve the quality of these raw materials through fermentation. Additionally, the impact of processing time and dough composition on the storage stability of sourdough starters was investigated, providing insights into the factors affecting the application of LAB starter cultures.

In Paper 1, it was confirmed that the naturally occurring LAB successfully established themselves in spontaneous fermentations of faba bean and pea flours. At low fermentation temperatures (22 °C), pH stabilisation was delayed, and microbial stability was not necessarily achieved concurrently. Conversely, a uniform population consisting mainly of Lactiplantibacillus spp. was obtained at higher temperatures (30 °C). Identification of LAB isolated from mature sourdoughs revealed a high prevalence of Lactiplantibacillus plantarum/pentosus and Pediococcus pentosaceus, along with the presence of Enterococcus durans, Lacticaseibacillus rhamnosus, and Leuconostoc mesenteroides/Leuconostoc citreum. These isolates, along with LAB isolated from cereal fermentations, were further investigated and characterised.

The screening of selected technological properties of LAB isolated from plant-based fermentations provided a foundation for combining nine isolates into five autochthonous starter cultures. The isolates exhibited varying capacities to ferment different carbohydrate substrates, acidify flour-like matrices, produce exopolysaccharides, and express extracellular protease and phytase activity, with one isolate exhibiting all these properties.

The five starter cultures were tested and compared to their individual strains for their ability to successfully ferment pulses (CM03/62 and CM65/92), wheat (JP47/51 and JP12/51), and oat (VL17/51) flours, depending on the origin of the isolates. Efficient substrate utilisation and acidification were confirmed for all starter cultures. Starter cultures CM03/62 and CM65/92 effectively reduced both raffinose (61-89%), vicine (55-61%), and convicine (9-29%) in pulse flour fermentation, a result that was not obtained with any single strain alone. Both cultures exhibited proteolytic activity, though no difference from individual strains was observed. In wheat flour fermentations, combined starter cultures JP47/51 and JP12/51 reduced phytic acid content by more than 50%, with no significant difference from individual strains. Proteolytic activity was significantly higher with JP47/51 than JP12/51, which was associated with low proteolytic activity of strain JP12. The starter culture VL17/51 tested in oat flour showed no extracellular protease activity or reduction of ANFs (raffinose and phytic acid).

Three different sourdough starters from production A, B and C were subjected to different fermentation times (A and B) and dough compositions (B and C) to evaluate their stability during cold storage. After 16 weeks at 4 °C, sourdough activity remained acceptable (> 7 log CFU/g) regardless of fermentation time, and longer fermentation positively affected free amino acid (FAA) concentrations. Changing the dough composition (addition of malted wheat flour and CaCO₃) resulted in higher pH, increased substrate availability, and a different fungal microbiota, leading to higher metabolic activity during cold storage. This, in turn, caused the viability of the sourdough starter to decline to an unacceptable level (< 7 log CFU/g) already after 8 weeks.

The findings presented in this thesis provide valuable knowledge for characterising and developing autochthonous starter cultures for plant-based food fermentations and highlight the importance of understanding the symbiotic interactions between members of the starter culture. In addition, insights into the effects of process parameters and ingredients on the stability of sourdough starters provide important perspectives for the application of LAB starter cultures.

Kosthold rikt på plantebaserte råvarer, som korn og belgfrukter, er et bærekraftig og næringsrikt alternativ til animalske proteinkilder. Disse råvarene er hver for seg ufullstendige proteinkilder, men til sammen bidrar de med en komplementær profil av essensielle aminosyrer (EAA) og sikrer et proteininntak av høy kvalitet. Den økte interessen for plantebaserte matvarer har også ført til oppmerksomhet rundt matvarenes innhold av antinæringsstoffer (ANS) som raffinose, fytinsyre, vicin og convicin. Det er nødvendig med egnede metoder for å forbedre egenskapene til disse råvarene med hensyn til utvikling av næringsrike, tiltalende og bærekraftige produkter. Med de rette mikroorganismene har fermentering et potensial til å forbedre næringsverdien og de organoleptiske egenskapene til plantebaserte matvarer. Det har blitt foreslått at naturlig forekommende mikroorganismer i råvarene egner seg som starterkultur til dette formålet. Hensikten med dette prosjektet var å karakterisere og evaluere bruk av starterkulturer bestående av naturlig tilstedeværende melkesyrebakterier (MSB) isolert fra spontanfermentering av åkerbønne-, erte-, hvete- og havremel, for å oppnå forbedret kvalitet til disse råvarene gjennom fermentering. I tillegg ble virkningen av fermenteringstid og deigsammensetning på lagringsstabiliteten til surdeigsstartere undersøkt. Dette vil bidra med økt kunnskap rundt anvendelsen av MSB-kulturer og faktorer som påvirker denne bruken.

Det ble bekreftet at de naturlig forekommende melkesyrebakteriene var i stand til å etablere seg ved spontanfermentering av åkerbønne- og ertemel. Ved lav fermenteringstemperatur (22 °C) tok det lenger tid før pH stabiliserte seg, og mikrobiell stabilitet ble ikke nødvendigvis oppnådd simultant. Ved høyere temperatur (30 °C) ble det derimot oppnådd en ensartet populasjon primært bestående av Lactiplantibacillus spp. Identifisering av MSB isolert fra etablerte surdeiger viste høyest forekomst av Lactiplantibacillus plantarum/pentosus og Pediococcus pentosaceus, sammen med Enterococcus durans, Lacticaseibacillus rhamnosus og Leuconostoc mesenteroides/Leuconostoc citreum. Disse isolatene, sammen med MSB isolert fra fermentering av korn, ble videre undersøkt og karakterisert.

Screening av utvalgte teknologiske egenskaper til MSB isolert fra plantebaserte fermenteringer ga grunnlag for å kombinere ni isolater til fem starterkulturer med naturlig tilstedeværende MSB fra planteråstoff. Isolatene viste varierende evne til å fermentere ulike karbohydratsubstrater, syrne melmedier, produsere eksopoly-sakkarider og danne ekstracellulære protease- og fytaseenzymer. Et av isolatene viste alle disse egenskapene.

De fem starterkulturene ble karakterisert og sammenlignet med sine individuelle stammer med hensyn til evne til å fermentere melblandinger av belgvekster (CM03/62 og CM65/92), hvete (JP47/51 og JP12/51) eller havre (VL17/51), avhengig av isolatenes opprinnelse. Effektiv substratutnyttelse og pH senkning ble bekreftet for alle starterkulturene. Starterkulturene CM03/62 og CM65/92 reduserte effektivt innhold av både raffinose (61-89 %), vicin (55-61 %) og convicin (9-29 %) ved fermentering av belgvekstmel. Dette resultatet ble ikke oppnådd med noen av enkeltstammene alene. Begge kulturene viste proteolytisk aktivitet, men det ble ikke observert noen forskjell hos de individuelle stammene. Ved fermentering av hvetemel reduserte starterkulturene JP47/51 og JP12/51 innholdet av fytinsyre med mer enn 50 %, uten at det var noen signifikant forskjell fra de individuelle stammene. Proteolytisk aktivitet var betydelig høyere med JP47/51 sammenlignet med JP12/51, noe som kan ha sammenheng med den lave proteolytiske aktiviteten til JP12. Starterkulturen VL17/51 viste ingen ekstracellulær proteaseaktivitet eller reduksjon av ANS (raffinose og fytinsyre) i havremel.

Tre ulike surdeigsstartere fra produksjon A, B og C ble produsert med ulike fermenteringstider (A og B) og deigsammensetninger (B og C) for å evaluere deres stabilitet etter kjølelagring. Etter 16 uker ved 4 °C var surdeigsaktiviteten fortsatt tilfredsstillende (> 7 log CFU/g) uavhengig av fermenteringstid, og samtidig påvirket lengre fermenteringstid konsentrasjonen av frie aminosyrer (FAA) positivt. Endring av deigsammensetningen (tilsetning av maltet hvetemel og CaCO₃) resulterte i høyere pH, økt substrattilgjengelighet og en endring i soppmikrobiotaen til surdeigs-starterne. Dette medførte høyere metabolsk aktivitet under kjølelagring, og førte til at aktiviteten til surdeigsstarteren ble redusert til et ikke akseptabelt nivå (< 7 log CFU/g) allerede etter 8 uker.

Resultatene som presenteres i denne avhandlingen gir verdifull kunnskap med hensyn til karakterisering og utvikling av starterkulturer med naturlig tilstedeværende MSB til fermentering av plantebasert mat, og understreker viktigheten av å forstå de symbiotiske interaksjonene mellom mikroorganismene i starterkulturen. I tillegg gir resultatene innsikt i effekten av prosessparametere og ingredienser på stabiliteten til surdeigsstartere. Dette gir viktige perspektiver med hensyn til anvendelse av MSB starterkulturer.