Elucidating the biology of bovine mastitis pathogens by novel molecular tools
Abstract
Staphylococcus aureus and Streptococcus dysgalactiae are major pathogens responsible for bovine mastitis, a significant disease that adversely affects animal health and imposes considerable economic burdens on the dairy industry, reducing milk yield and quality. Despite widespread control strategies, bovine mastitis remains difficult to treat and eradicate, and new treatment strategies are therefore needed. While the importance of these pathogens is well-recognized, our understanding of the molecular mechanisms underlying their adaptation, persistence, and virulence in the mammary gland remains limited. Improved knowledge into these mechanisms and tools to study these pathogens could pave the way for improved treatment strategies for bovine mastitis and supporting the development of targeted antimicrobials. This thesis presents (i) novel genetic tools for identifying and studying fitness determinants relevant to bovine mastitis in S. aureus and Str. dysgalactiae, (ii) new insights into key pathways and mechanisms for S. aureus proliferation in milk, and (iii) characterization of ScrM in Str. dysgalactiae, a lytic protein which could be developed into a potential new antimicrobial for treatment and prevention of mastitis. Collectively, these findings provide a basis for future studies of bacterial pathogenesis and adaptation, exploration of novel treatment targets, and investigations into antimicrobial applications.
In paper I we address crucial knowledge gaps concerning S. aureus fitness determinants in milk, a key environment for bacterial growth during mastitis. To dissect the genetic factors supporting S. aureus growth in milk, we developed and applied CRISPR interference sequencing (CRISPRi-seq) for genome-wide fitness screens. This approach uncovered critical pathways for S. aureus growth in milk, including purine biosynthesis, the folate cycle, and metal acquisition pathways, which may serve as potential therapeutic targets for mastitis. Additionally, we observed that milk sensitizes S. aureus to the antibiotic trimethoprim-sulfamethoxazole (TMP-SMX). Further CRISPRi-seq screens under TMP-SMX exposure identified specific genes, such as those involved in nucleoside import and DNA repair, which further modulate TMP-SMX susceptibility. We also found that S. aureus relies less on cell wall components like teichoic acids in milk, which also has an impact on antimicrobial susceptibility. The implementation of CRISPRi-seq in S. aureus enables further studies in infection-relevant environments, advancing our understanding of the pathogen's adaptive strategies and pathogenesis.
In paper II, we expanded the molecular toolkit available for Str. dysgalactiae by establishing natural transformation as a method for genetic modification, previously challenging for this pathogen. By implementing a natural transformation-based approach, we enabled targeted gene modifications in both bovine- and human-adapted Str. dysgalactiae, providing a foundational toolkit for future functional analyses. As a proof-of-concept, we created knockout mutants of lacZ and lacG, two β-galactosidase genes, involved in lactose utilization. Bovine-adapted strains harbor both lacZ and lacG, while human adapted strains harbor only lacZ, a difference that have been implicated in host adaptation. Our results demonstrated that while lacG is essential for lactose metabolism in bovine-associated strains, lacZ alone does not support growth on lactose. This genetic distinction underscores host-specific adaptations in Str. dysgalactiae. By establishing this protocol, we have laid the groundwork for targeted investigations into genetic factors driving adaptation and virulence in Str. dysgalactiae, which could contribute to identifying new treatment strategies for combating bovine mastitis caused by this pathogen.
In paper III, we characterized the antimicrobial murein hydrolase ScrM produced by Str. dysgalactiae, and its associated immunity protein, ScrI. ScrM, which is expressed during competence, demonstrated targeted lytic activity against closely related streptococci. Using sfGFP fusions and fluorescence microscopy, we showed that ScrM specifically binds to the division zone of susceptible cells, a process mediated by an uncharacterized conserved C-terminal domain (CCD). Competent cells avoid self-lysis through the immunity protein ScrI, a Fem-transferase-like enzyme that modifies the interpeptide bridge of the peptidoglycan by incorporating threonine in place of alanine, thus preventing ScrM binding at the division zone. This work not only sheds light on the role and mechanism of ScrM, but also suggests potential applications for ScrM as a lytic enzyme in antimicrobial strategies. Jurbetennelse, også kalt mastitt, hos kyr er en stor utfordring for melkeindustrien over hele verden. I tillegg til å skape smerte og ubehag for dyrene, påvirker mastitt både melkemengde og kvalitet, noe som fører til store økonomiske tap. Mastitt hos kyr kan være svært vanskelig å behandle og å bli kvitt, og vi trenger derfor å utvikle nye og bedre behandlinger. Blant bakteriene som forårsaker mastitt er Staphylococcus aureus og Streptococcus dysgalactiae to av de vanligste årsakene. Selv om disse bakteriene er kjente årsaker til mastitt, har vi fortsatt begrenset forståelse for hvordan disse bakteriene tilpasser seg og overlever i juret og hvordan de forårsaker infeksjon. Økt innsikt i disse mekanismene kan føre til forbedring av eksisterende behandlingsstrategier for mastitt og for utvikling av nye målrettede antimikrobielle midler. Denne avhandlingen presenterer (i) nye genetiske verktøy for å identifisere og studere genetiske faktorer som påvirker evnen til S. aureus og Str. dysgalactiae til å forårsake sykdom, (ii) ny innsikt i sentrale mekanismer som er viktig for at S. aureus kan vokse i melk, og (iii) karakterisering av ScrM, et mulig nytt antimikrobielt protein for behandling og forebygging av mastitt. Samlet legger disse funnene grunnlaget for fremtidige studier av bakterienes evne til tilpasning og hvordan de forårsaker sykdom, identifisering av nye behandlingsmål og nye antimikrobielle strategier.
I artikkel I blir S. aureus sin vekst i melk studert. Vekst i melk er viktig for utvikling av infeksjon i juret, men det er fortsatt store mangler i kunnskapen vår om hvordan dette skjer. For å forstå hvilke genetiske faktorer som bidrar til S. aureus sin vekst i melk, utviklet og anvendte vi CRISPR interferens sekvensering (CRISPRi-seq) for å gjennomføre analyser som kartlegger S. aureus genene sin betydning for bakteriens overlevelse og tilpasning. Dette avdekket mekanismer som er sentrale for S. aureus sin vekst i melk, inkludert purinbiosyntese, folat syklusen, og opptak av essensielle metaller. Disse mekanismene kan være mulige mål for behandling av mastitt. Videre observerte vi at melk gjør S. aureus mer sensitiv for antibiotikumet trimetoprim-sulfametoksazol (TMP-SMX). Ytterligere CRISPRi-seq-analyser under TMP-SMX-behandling viste videre at spesifikke gener, som de involvert i nukleosidimport og DNA-reparasjon, ytterligere påvirker sensitiviteten for TMP-SMX. Vi fant også at S. aureus er mindre avhengig av celleveggelementer som teikoinsyrer når de vokser i melk, og dette påvirker også antibiotika sensitiviteten. Implementeringen av CRISPRi-seq i S. aureus åpner for videre studier i infeksjonsrelevante miljøer, noe som kan gi dypere innsikt i bakteriens tilpasningsstrategier og patogenese.
Str. dysgalactiae har vært vanskelig å studere på grunn av manglende verktøy for genfunksjonsanalyser. I artikkel II har vi funnet en løsning på dette ved å etablere en metode som muliggjør genetiske modifikasjoner i storfe- og menneskeassosierte stammer av Str. dysgalactiae. Metoden, som er basert på en prosess som kalles naturlig transformasjon, legger grunnlaget for fremtidig karakterisering av gener som er viktig for Str. dysgalactie tilpasning og infeksjon. Som et eksempel på bruk av metoden har vi laget delesjonsmutanter av genene lacZ og lacG, to β-galaktosidase-gener antatt å være involvert i laktosemetabolisme. I storfe-assosierte stammer er både lacZ og lacG til stede, mens menneskeassosierte stammer kun har lacZ, noe som har blitt indikert til å reflektere tilpasning til ulike vertsorganismer. Våre funn viste at lacG er essensielt for laktosemetabolisme i storfeassosierte stammer, mens lacZ alene ikke gir vekst på laktose. Denne forskjellen fremhever verts-spesifikke tilpasninger hos Str. dysgalactiae. Med denne protokollen har vi lagt et fundament for å undersøke genetiske faktorer som bidrar til tilpasning og sykdomsfremkalling hos Str. dysgalactiae, noe som kan bidra til å identifisere nye behandlingsstrategier for mastitt forårsaket av denne bakterien.
I artikkel III karakteriserte vi den antimikrobielle mureinhydrolasen ScrM som produseres av Str. dysgalactiae, samt det tilhørende immunitetsproteinet, ScrI. ScrM uttrykkes under kompetanse for naturlig transformasjon, og viser målrettet lytisk aktivitet mot nært beslektede streptokokker. Ved hjelp av sfGFP-fusjoner og fluorescensmikroskopi viste vi at ScrM binder spesifikt til delingssonen i sensitive celler, en prosess som ser ut til å være styrt av et hittil ukarakterisert, konservert domene. Kompetente celler unngår selvmord ved hjelp av immunitetsproteinet ScrI, et Fem-transferase-lignende enzym som modifiserer interpeptidbroene i peptidoglykan ved å bytte ut alanin med treonin. Dette forhindrer ScrM i å binde seg til delingssonen. Denne studien gir ikke bare innsikt i funksjonen og mekanismen til ScrM, men peker også på potensialet for å bruke ScrM som et lytisk enzym for behandling eller forebygging av mastitt.