De Novo Design of Copper Enzymes Using RFdiffusion

Abstract

Metalloproteindesign er et sentralt forskningsområde grunnet de unike redoksegenskapene til metallkomplekser, med potensielle anvendelser i mange industrielle prosesser. COOFIX-prosjektet har som mål å designe nye metalloenzymer som kan katalysere omdannelsen av karbondioksid (CO₂) til verdifulle produkter. I denne oppgaven ble et kobber (II)-kompleks brukt som utgangspunkt for å generere en protein backbon ved hjelp av RFdiffusion. Deretter ble et meldingspasserende nevralt nettverk (MPNN) brukt for å utvikle en aminosyresekvens som forventes å folde seg i samsvar med den foreslåtte backbon strukturen. Proteinstrukturen ble deretter prediktert med ColabFold.

Den genererte aminosyresekvensen ble oversatt til genetisk kode, og sekvensene ble uttrykt i Escherichia coli ved bruk av rekombinante proteinteknikker. Etter ekspresjon ble proteinene renset og analysert med ulike metoder for eksperimentell validering. EPR-spektroskopi (elektronparamagnetisk resonans) ble benyttet for å undersøke metallets koordinasjonsmiljø, mens røntgenkrystallografi ble brukt til å belyse proteinets strukturelle detaljer. Kandidatenzymernes oksidaseaktivitet ble vurdert ved bruk av Amplex Red-assay.

EPR-analysen av Design 2 viste et karakteristisk spektrum for kobber (II)-komplekser med aksial geometri (gx ≃ gy < gz og g⊥ > g∥). Mutering eksperiment viste at en bestemt aminosyre, som var forventet å delta i kobberkoordinasjon, hadde minimal påvirkning, da mutanten hadde lignende g-tensorverdier som villtypen. Dataene antydet også tilstedeværelsen av flere kobberarter, men ytterligere analyser er nødvendige for å bekrefte dette. Røntgenkrystallografi viste god overensstemmelse mellom den eksperimentelle strukturen og AlphaFold2-prediksjonen, unntatt en histidin som viste en høy pLDDT. Denne histidinen var også den samme som viste seg til å ikke være med på kobberkoordinasjon ifølge mutering eksperimentet og følgende EPR-analysen til mutanten.

Amplex Red-analysene antydet at Design 2 kan redusere molekylært oksygen til hydrogenperoksid i nærvær av kobber, noe som indikerer mulig oksidaseaktivitet. Ytterligere studier er imidlertid nødvendige for å validere kobberkoordinasjonen og enzymets katalytiske egenskaper.

Metalloprotein design is a crucial area of research due to the unique redox chemistry exhibited by metal centers, which has potential applications in many industries. The COOFIX project aims to design novel metalloenzymes capable of converting substrates like carbon dioxide into valuable products. To design an enzyme with the potential for converting CO2, we started with a single copper (II) complex. This complex was utilized as an input for RFdiffusion to generate protein backbones incorporating the small copper complex ligand. Subsequently, a message-passing neural network (MPNN) was employed to generate an amino acid sequence predicted to fold into the shape of the generated backbone. ColabFold was then used to predict the protein structure based on the amino acid sequence. The amino acid sequence was translated into a genetic code, which served as the starting point for synthesizing the virtual data into real-world substances. The generated sequences were expressed in E. coli using recombinant protein techniques. Following expression, the proteins were purified and subjected to various analytical methods for experimental validation. EPR spectroscopy was used to investigate the coordination environment of the metal in the reaction center. X-ray crystallography was employed to elucidate the structural details of the proteins. Additionally, the oxidase activity of the candidate enzymes was assessed using the Amplex Red assay.

Electron paramagnetic resonance (EPR) analysis of Design 2 revealed an axial geometry typical of copper (II) complexes, with gx ≃ gy < gz and g⊥ > g∥. Mutagenesis experiments indicated that one of the amino acid side chains predicted to bind copper contributed minimally to copper coordination, as the mutated variant showed almost similar g-tensors values to the wild type. Additionally, EPR data suggested the presence of multiple copper species, although higher-quality data is needed for confirmation. Structural analysis via X-ray crystallography demonstrated a strong correlation between the experimentally obtained structure and the prediction by AlphaFold2 globally. However, it showed a high pLTTD for one Histidine that served as a nitrogen donor in the copper complex. Interestingly, this amino acid is the same that showed minimal contribution in the coordination of the copper atom. Amplex red assays suggest that Design 2 may reduce molecular oxygen to hydrogen peroxide in the presence of Cu, indicating potential oxidase activity. However, further investigations are required to confirm its ability to coordinate copper and to elucidate its catalytic capabilities.