Testing og optimalisering av molekylærbiologiske diagnostikkmetoder for ringorm hos storfe
Abstract
Ringorm er en hudsykdom som påvirker både mennesker og dyr. Den blir forårsaket av dermatofytter, en gruppe sopparter som livnærer seg av keratin, som er en av hovedkomponentene i huden. Når ringorm forårsaket av dermatofytten Trichophyton verrucosum rammer storfe, kategoriseres det som en nasjonal liste 2-sykdom av Mattilsynet, og er dermed meldepliktig. Når det er mistanke om et utbrudd med T. verrucosum, blir besetningen båndlagt. Hud fra norsk storfe er i tillegg en lukrativ eksportvare til store, internasjonale merkevarer på grunn av den høye kvaliteten. Det er derfor stor interesse for en rask diagnostikkprosess, både for gårdsdriften, dyrevelferden og BNP.
I dag diagnostiseres ringorm i Norge med klassiske, mikrobiologiske diagnostikkmetoder, ved å blant annet analysere mikro- og makro-karakteristika av kolonier fra kultiverte hårprøver. Den største utfordringen med dagens diagnostisering av ringorm er at den er tidskrevende, da den kan ta opptil 14 dager å kvittere ut et sikkert, negativt resultat. En molekylærbiologisk diagnostikkmetode kan være løsningen på dette.
I dette prosjektet ble det testet tre ulike PCR-metoder. Den ene var en Endepunkts-PCR for generell soppidentifisering fra Veterinærinstituttet. De to andre kom fra kommersielt tilgjengelige kits. Den ene var DermaGenius® 2.0 Complete Multiplex Real-Time PCR Kit utviklet av PathoNostics B.V., det andre var Trichophyton verrucosum – Real Time DNA PCR Kit, utviklet av BioinGentech. Det ble avgjort å jobbe videre var DermaGenius® 2.0, ved å optimalisere DNA-ekstraksjonen og PCR-metoden. For å optimalisere DNA-ekstraksjonen ble hårprøvene forbehandlet med inkubering i Proteinase K-løsning, og for å optimalisere PCR-prosessen ble det testet ulike uttaksvolum fra hår- og Proteinase K-blandingen, i tillegg til ulike fortynninger av det ekstraherte DNA-materialet. Dette resulterte i en optimalisert molekylærbiologisk diagnostikkmetode for T. verrucosum, men som trenger validering i videre arbeid. Ringworm is a skin infection that can affect both humans and animals. It is caused by dermatophytes, a group of fungi that can utilize the keratin in the skin. When bovine ringworm is caused by the dermatophyte Trichophyton verrucosum, it is classified as a national list 2-disease by The Norwegian Food Safety Authority, and will therefore result in certain restrictions for the farm. When there is suspected an outbreak of bovine ringworm caused by T. verrucosum, a restraint is put on the stock. In addition are leathers from Norwegian cattle a greatly lucrative export product for large, international brands, because of the good quality they hold. It is therefore of great interest to develop a fast and reliable diagnostics method, on account of the farm’s operation, animal welfare, and the GDP.
Bovine ringworm is diagnosed in Norway today by using classical, microbiological diagnostics methods, like analyzing micro and macro characteristics of the colonies cultivated from hair samples. The greatest challenge with today’s method of ringworm diagnostics, is that the process is somewhat long and can take up to 14 days before a negative result is confirmed. A molecular diagnostic method could be the solution to this.
There were tested three different PCR methods in this dissertation. Firstly, an endpoint PCR for general fungal identification from The Norwegian Veterinary Institute was tested. The two others were commercial kits, the first one being the DermaGenius® 2.0 Complete Multiplex Real-Time PCR Kit developed by PathoNostics B.V., and the second being the Trichophyton verrucosum – Real Time DNA PCR Kit developed by BioinGentech. It was decided to continue optimizing the DermaGenius® 2.0 Kit, by optimizing the DNA extraction process, in addition to the PCR process. To optimize the DNA extraction, the hair samples were incubated in a Proteinase K buffer as a pretreatment. To optimize the PCR-process, there were tested different pipetting volumes from the hair- and Proteinase K buffer-solution, as well as different dilutions of the extracted DNA-material. This resulted in an optimized molecular diagnostic method for T. verrucosum, which however needs further validation.