Serological diagnosis of maedi-visna in Norwegian sheep

Abstract

Maedi-visna (MV) is a disease which affects small ruminants. The disease is caused by maedi-visna virus (MVV), and is spread worldwide. As there is no treatment or vaccine for the disease, effective surveillance and control measures are important to prevent the disease from spreading. In Norway, a national surveillance programme funded by the government has been in place since 2003, with the aim of eliminating MVV in the country. In 2019, MVV was detected through the national surveillance programme, 14 years after the last detection of the virus in Norway. As the viral strain detected in the two outbreaks (2002–2005 and 2019–2020) showed high genetic similarities in selected viral segments, it was therefore assumed that the virus had circulated in the sheep population despite continuous surveillance. This observation underscored the need for an improved surveillance. Therefore, the overall aim of this thesis was to improve the serological diagnostics used to detect MVV infection in Norway.

Firstly, this thesis aimed at describing previous enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) test results from the past two outbreaks. In both outbreaks, all samples were analysed with a screening ELISA and those positive, were further analysed in a verification ELISA. The three different commercial ELISA tests used in the first study were found to show discrepant results. Only 206 out of 508 samples positive in the screening ELISA were positive in the two other ELISA tests investigated, illustrating that the choice of tests used in a surveillance programme will influence the number of animals and therefore possibly farms, defined as positive. Furthermore, in this thesis the resampling of animals positive in the screening but negative in the verification ELISA one week to three months later, found that only 38% and 26% of such animals turned to agreeing results in positive and negative flocks, respectively. In infected flocks, the seroprevalence increased until three years of age. In addition, comparing the serological result in mothers and their offspring revealed that most lambs were seronegative regardless of the status of their mother.

Secondly, this thesis aimed at evaluating the commercial ELISA tests currently used in the national surveillance programme. Therefore, a Bayesian latent class analysis of three commercial ELISA tests was performed. Results show that ID Screen® MVV/CAEV Indirect kit (IDvet Grabels, France) and Elitest MVV/CAEV (Hyphen Biomed, Neuville-sur-Oise, France) (hereinafter referred to as IDscreen and Elitest, respectively) had significantly higher estimated diagnostic sensitivity than MVV/CAEV p28 Ab Verification Test (IDEXX Laboratories, Maine, USA) (hereinafter referred to as IDEXXp28), while IDscreen and IDEXXp28 had significantly higher estimated diagnostic specificity than Elitest. Further, the serial combination of two tests improved the positive predictive value, and the combination of either IDscreen and Elitest or IDscreen and IDEXXp28 if the cut-off value for IDEXXp28 was altered (cut-off value lowered from sample to positive ratio (S/P)% of 110, as stated by the manufacturer, to S/P% of 87) showed the highest positive predictive value in a population with low prevalence, as in Norway.

The third aim of this thesis was to develop a bead-based multiplex immunoassay for the detection of antibodies against MVV. To customise the assay for use in the Norwegian sheep population, antigens based on sequencing results from the circulating viral strain in Norway during 2019–2020 were included. The work included optimisation of the assay and the further evaluation of the analytical properties. The assay included the gag antigens p25 and p16–25, and the env antigen SU5 based on the Norwegian circulating viral strain, and a commercial env TM-A antigen. The repeatability was measured in coefficient of variation (CV), and as recommended by the World Organisation for Animal Health, most of the positive samples (30 out of 32) showed a CV below 15%. All of the positive samples showed a CV below 20%. The analytical sensitivity was compared to IDscreen, and the multiplex assay could detect antibodies at an equal or even lower concentration than IDscreen (the sample dilutions representing the lowest limit of detection for the multiplex assay ranged from 1:400 to 1:12800, while the range was 1:200 to 1:800 for IDscreen). The analytical specificity varied from 91.7–95.0% for the various antigens, when compared to samples negative in IDscreen.

In conclusion, the current testing regime of MVV based on commercial ELISAs was found to have an increased sensitivity and positive predictive value if the cut-off value for the verification test was lowered compared to the cut-off recommended by the manufacturer, or if the verification test was changed from IDEXXp28 to Elitest. However, if elimination of MVV is the end goal, the current testing regime should be changed from a regime with a high positive predictive value towards a regime with a high negative predictive value. Furthermore, results in this thesis confirm that the sampling should focus on the older animals to increase the likelihood of finding flocks with seropositive animals. Results from the development of a bead-based multiplex immunoassay were promising, as illustrated by high analytical performance, and the assay can possibly either replace the commercial ELISA tests currently used for MVV antibody detection or be used as a supplement. However, further evaluation of the diagnostic characteristics is needed before implementation.

Mædi-visna (MV) er en sykdom hos småfe forårsaket av mædi-visna virus (MVV) som er utbredt over hele verden. Det finnes hverken vaksiner eller behandling mot sykdommen, derfor er effektiv overvåking og gode kontrolltiltak viktig for å forebygge spredning. Det har vært et statlig finansiert nasjonalt overvåkingsprogram i Norge siden 2003. Det er et nasjonalt mål å utrydde MVV i landet. I 2019 ble MVV påvist gjennom det nasjonale overvåkingsprogrammet, 14 år etter forrige påvisning i Norge. Virusstammene som ble påvist i de to utbruddene (i 2002–2005 og 2019–2020) viste genetiske likheter når spesifikke segmenter ble undersøkt, og det har derfor blitt antatt at viruset har sirkulert i sauepopulasjonen til tross for kontinuerlig overvåking. Dette understreker behovet for en forbedret overvåking. Hovedmålet med denne avhandlingen var derfor å forbedre den serologiske diagnostikken som brukes til å påvise MVV-infeksjon i Norge.

Det første delmålet var å beskrive tidligere enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) testresultater fra de to siste utbruddene. Ved begge utbruddene ble alle prøver analysert med en screening ELISA, og kun de positive prøvene ble videre analysert i en verifiserende ELISA. De tre forskjellige kommersielle ELISA-testene som ble undersøkt i denne studien, gav ulike resultater. Kun 206 av 508 prøver positive i screening ELISA-testen gav positive resultater i de to andre ELISA-testene, noe som illustrerer at valg av tester som inkluderes i overvåkingsprogrammet vil påvirke antall dyr og muligens antall besetninger som blir definert som positive. Videre ble testresultatene fra ny prøvetaking etter en uke til tre måneder undersøkt. Den nye prøvetakingen var av dyr som ved første prøvetaking var positive i screeningtesten og negative i den verifiserende testen. Kun 38 % og 26 % av dyrene fikk samme resultat i begge testene etter ny prøvetaking, i henholdsvis positive og negative besetninger. I besetninger diagnostisert med MVV, økte seroprevalensen frem til tre års alder. I tillegg, ved sammenligning av serologiske resultater fra mordyr og deres avkom var de fleste lam seronegative uavhengige av mordyrets status.

Det andre delmålet gikk ut på å evaluere de kommersielle testene som ble brukt i det nasjonale overvåkingsprogrammet. Derfor ble det utført en Bayesiansk latent class analyse (BLCA) av tre kommersielle ELISA-tester. Resultatene viste at ID Screen® MVV/CAEV Indirect kit (IDvet Grabels, France) og Elitest MVV/CAEV (Hyphen Biomed, Neuville-sur-Oise, France) (heretter kalt for henholdsvis IDscreen og Elitest) hadde signifikant høyere estimater for sensitivitet enn MVV/CAEV p28 Ab Verification Test (IDEXX Laboratories, Maine, USA) (heretter kalt for IDEXXp28), mens IDscreen og IDEXXp28 hadde signifikant høyere estimert spesifisitet enn Elitest. Videre ble den positive prediktive verdien forbedret når en seriekombinasjon av to tester ble brukt, og kombinasjonen av enten IDscreen og Elitest eller IDscreen og IDEXXp28 dersom cut off-verdien til IDEXXp28 ble endret (cut off-verdien ble senket fra en sample to positive ratio (S/P) % på 110, anbefalt av produsenten, til S/P% på 87) viste høyest positiv prediktiv verdi i en populasjon med lav prevalens, slik som i Norge.

Det tredje delmålet var å utvikle en kulebasert multipleks immunoassay for å detektere antistoffer mot MVV. For å gjøre testen mest mulig egnet for bruk i den norske sauepopulasjonen, ble antigener basert på sekvenseringsresultater fra virusstammen som sirkulerte i Norge i 2019–2020 inkludert. Arbeidet inkluderte optimalisering av metoden samt evaluering av testens analytiske egenskaper. Den endelige multiplekstesten besto av gag antigenene p25 og p16–25, samt env antigenet SU5 basert på det norske viruset, samt et kommersielt env TM-A antigen. Repeterbarheten ble målt i variasjonskoeffisient (CV), og som anbefalt av Verdens dyrehelseorganisasjon (WOAH), viste de fleste positive prøvene (30 av 32) en CV under 15 %. Alle de positive prøvene hadde en CV under 20 %. Den analytiske sensitiviteten ble sammenlignet med IDscreen, og multiplekstesten kunne detektere antistoff ved tilsvarende, eller lavere, konsentrasjon enn IDscreen (serumfortynningene som fortsatt gav positive utslag i multiplekstesten varierte fra mellom 1:400 til 1:12800, mens for IDscreen varierte det fra mellom 1:200 til 1:800). Den analytiske spesifisiteten varierte mellom 91.7–95.0 % for de ulike antigenene, når testresultatene ble sammenlignet med prøver negative i IDscreen.

Konklusjonen er at det nåværende testingsregimet bestående av to kommersielle ELISA tester vil få økt sensitivitet og positiv prediktiv verdi dersom cut off-verdien for den verifiserende testen senkes sammenlignet med den anbefalte cut off-verdien fra produsenten, eller verifiseringstesten byttes ut fra IDEXXp28 til Elitest. Dog, dersom målet er å bli kvitt MVV i Norge bør testingsregimet endres fra et ønske om høy positiv prediktiv verdi til et ønske om høy negativ prediktiv verdi. Videre bekrefter resultatene at prøvetakingen bør fokusere på de eldste dyrene i besetningene, for å øke sjansen til å finne besetningene med seropositive dyr. Utviklingen av en ny kulebasert multipleks immunoassay som inkluderer antigen basert på den norske virusstammen viser lovende resultater, illustrert av gode analytiske egenskaper, og testen kan i fremtiden potensielt enten erstatte de nåværende ELISA-testene som brukes i diagnostikken, eller brukes som en supplerende test. Før dette kan bli mulig, bør i midlertidig de diagnostiske egenskapene til den nye testen evalueres.