Drug screening identifies potential small molecule inhibitors to target transcriptionally heterogeneous glioblastoma stem cells

Abstract

Glioblastoma (GBM) is the most prevalent and deadly primary intrinsic brain tumour in adults. The inter- and intratumoural heterogeneity of GBM together with high recurrence rates and difficulty of transporting drugs past the Blood Brain Barrier (BBB) complicates effective treatment. Although diagnostic accuracy has improved following the switch from histological to molecular assessment of tumour tissue, the lack of effective treatment renders GBM an effective death sentence. It is widely appreciated that this high rate of GBM recurrence is driven by a subpopulation of Glioma stem-like cells (GSC) co-existing with differentiated cell populations. The complex transcriptional programs required to sustain the balance of these subpopulations might also provide therapeutic opportunities due to GBM’s dependency on them. There is contrasting evidence of both a complete dependency and a lack of such for core Transcription Factors. As such, we aimed to further investigate the heterogeneity of the core TFs OLIG2, SOX2, SOX9, POU3F2 and FOXG1 in primary patient derived GSC lines. Western blot experiments showed heterogeneous expression of OLIG2 and SOX9 with SOX2, POU3F2 and FOXG1 being universally expressed across cell lines. To distinguish cell line-specific phenotypes from TF-specific phenotypes, we transfected GSCs expressing OLIG2 using a CRISPR-Cas9 RiboNucleoProtein (RNP). Fluorescence Activated Single Cell Sorting was used to generate isogenic clonal cell lines. To assess implications of TF heterogeneity in GSC survival and resistance to treatment, we performed high throughput screening of small molecule inhibitors. 374 compounds were initially identified as “hits”, reducing cell viability of the GSC lines below 47% of the control (DMSO). 242 compounds were validated in triplicate and scrutinized for potential differences in efficacy between different targets and cell lines based on expression levels of TFs. This thesis provides insights into core TF heterogeneity in GSCs and it’s implications of drug efficacy, laying the groundwork for future studies to potentially further investigate the most promising lead compounds and their relationship with the heterogeneous expression levels of primary patient derived GSCs.

Glioblastom (GBM) er den mest utbredte og dødelige primære indre hjernesvulsten hos voksne. Den inter- og intratumorale heterogeniteten til GBM sammen med høye tilbakefallsrater og vansker med å transportere legemidler forbi blodhjernebarrieren (BBB) kompliserer effektiv behandling. Selv om den diagnostiske nøyaktigheten har blitt bedre etter overgangen fra histologisk til molekylær vurdering av tumorvev, gjør mangelen på effektiv behandling GBM til en effektiv dødsdom. Det er allment verdsatt at denne høye frekvensen av GBM-tilbakefall er drevet av en underpopulasjon av Glioma stamlignende celler (GSC) som eksisterer samtidig med differensierte cellepopulasjoner. De komplekse transkripsjonsprogrammene som kreves for å opprettholde balansen mellom disse underpopulasjonene, kan også gi terapeutiske muligheter grunnet GBMs avhengighet av dem. Det er motstridende bevis på både en fullstendig avhengighet og mangel på slike for kjernetranskripsjonsfaktorer. Som sådan hadde vi som mål å undersøke heterogeniteten til kjerne-TFene OLIG2, SOX2, SOX9, POU3F2 og FOXG1 i primære pasientavledede GSC-linjer. Western blot-eksperimenter viste heterogen ekspresjon av OLIG2 og SOX9 med SOX2, POU3F2 og FOXG1 som universelt uttrykt over cellelinjer. For å skille cellelinjespesifikke fenotyper fra TF-spesifikke fenotyper, transfekterte vi GSCer som uttrykker OLIG2 ved hjelp av et CRISPR-Cas9 RiboNucleoProtein (RNP). Fluorescens-aktivert enkeltcellesortering ble brukt til å generere isogene klonale cellelinjer. For å vurdere implikasjoner av TF-heterogenitet i GSCoverlevelse og resistens mot behandling, utførte vi høy gjennomstrømningsscreening av småmolekylære hemmere. 374 forbindelser ble opprinnelig identifisert som "treff", noe som reduserte cellenes levedyktighet av GSC-linjene under 47% av kontrollen (DMSO). 242 forbindelser ble validert i triplikat og undersøkt for potensielle forskjeller i effekt mellom forskjellige mål og cellelinjer basert på ekspresjonsnivåer av TF. Denne avhandlingen gir innsikt i kjerne TF-heterogenitet i GSC og dens implikasjoner av legemiddeleffektivitet, og legger grunnlaget for fremtidige studier for potensielt å undersøke de mest lovende forbindelsene og deres forhold til de heterogene ekspresjonsnivåene til primære pasientavledede GSC-er.