Karakterisering av glykosidhydrolasene PaGH50 og PslG: Potensiale for å hemme Pseudomonas aeruginosa-biofilm ved nedbrytning av eksopolysakkaridet Psl

Abstract

Pseudomonas aeruginosa er en gramnegativ, patogen stav-bakterie som utgjør en betydelig trussel i dagens samfunn, da den kan forårsake både akutte og kroniske infeksjoner. Blant annet danner bakterien en biofilm som fungerer som en viktig virulensfaktor ved å gjøre bakteriene mer motstandsdyktige mot antimikrobielle midler. En viktig komponent i biofilmen er det ekstracellulære polysakkaridet Psl, sammensatt av et gjentakende pentasakkaridmotiv bestående av D-mannose, L-rhamnose og D-glukose bundet sammen av alfa/beta-1,3-glykosidbindinger.

Formålet for denne studien var først å produsere og rense enzymene PaGH50 og PslG fra P. aeruginosa, for deretter å undersøke enzymenes potensielle evne til å bryte ned Psl for å forhindre dannelsen av biofilm hos bakteriestammen P. aeruginosa PAO1.

Etter vellykket transformasjon, produksjon og rensing av enzymene fra Escherichia coli BL21 Star celler, og etter bekreftelse av PaGH50-enzymets aktivitet mot curdlan, ble det funnet at PaGH50 ikke forhindret biofilmformasjon hos P. aeruginosa PAO1. Imidlertid ble det bekreftet at PslG kunne fullstendig inhibere dannelsen av P. aeruginosa PAO1-biofilm. Resultatene fra aktivitetsanalysene MBTH og MALDI-TOF bekreftet at PaGH50 hydrolyserte beta-1,3-glykosidbindingene i curdlan til primært tetrasakkarider. I tillegg indikerte resultatene at PslG ikke har aktivitet mot curdlan, noe som underbygger antagelsen om at enzymet bryter beta-1,3-bindingen mellom Mannose og Rhamnose i Psl. Ettersom PaGH50 ikke viste seg å være aktiv mot P. aeruginosa PAO1-biofilm, ble det bestemt å rense Psl for å undersøke enzymets potensielle aktivitet. På grunn av utfordringer knyttet til det antatte rensede Psl-substratet, trengs det ytterligere forskning før eventuell aktivitet til PaGH50 mot Psl kan bekreftes.

Framtidig forskning rettet mot PaGH50 sin spesifikke funksjon i P. aeruginosa, inkludert undersøkelse av enzymets potensielle aktivitet mot beta-1,3-glukan for å vurdere om dette kan øke følsomheten til P. aeruginosa mot antibiotikumet kanamycin, kan gi en dypere forståelse av hvordan man kan bekjempe bakterien. I tillegg bør PslG testes i kombinasjon med antimikrobielle midler for å vurdere muligheten til å utvikle nye metoder for å bekjempe P. aeruginosa-infeksjoner.

Pseudomonas aeruginosa, a gram-negative, pathogenic rod-shaped bacterium poses a significant threat in society as it can cause acute and chronic infections. The bacteria form a biofilm, where the biofilm serves as a significant virulence factor by strengthening the bacterium’s resistant to antimicrobial agents. A crucial competent of the biofilm is the extracellular polysaccharide Psl, composed of a repeated pentasaccharide motif of D-mannose, L-rhamnose and D-glucose linked by alpha/beta-1,3-glcosidic bonds.

The main aim of this thesis was to first produce and purify the enzymes PaGH50 and PslG, and then investigate the enzymes’ potential ability to hydrolyze Psl to prevent biofilm formation of the bacterial strain P. aeruginosa PAO1.

Following successful transformation, protein production, and purification of the enzymes from Escherichia coli BL21 Star cells, and upon conformation of PaGH50 enzymes activity against curdlan, it was found that PaGH50 did not prevent biofilm formation in P. aeruginosa PAO1. It was however confirmed that PslG would completely inhibit the formation of P. aeruginosa PAO1-biofilm. The results from the activity analyses MBTH and MALDI-TOF confirmed that PaGH50 hydrolyzed the beta-1,3-glycosidic bonds in curdlan to primarily tetrasaccharides. Additionally, the results did indicate that PslG had no activity against curdlan, supporting the hypothesis that the enzyme cleaves the beta-1,3-linkage between Mannose and Rhamnose in Psl. Since PaGH50 was not active against P. aeruginosa PAO1-biofilm, it was decided to purify Psl to investigate the enzymes potential activity. Due to challenges associated with the presumed purified Psl substrate, further study is needed before PaGH50 potentially activity against Psl can be confirmed.

Future research aimed at revealing the specific function of PaGH050 in P. aeruginosa, including the investigation of the enzyme’s potential activity against beta-1,3-glucan to assess whether this could potentially increase P. aeruginosa sensitivity to the antibiotic kanamycin, may provide a deeper understanding in how to fight the bacterium. Additionally, PslG should be tested in combination with antimicrobial agents to explore the possibility of developing new methods to combat P. aeruginosa infections.