Exploring denitrifying bacteria’s resilience: impact of oxidative and nitrosative stress on NirS/NirK and NosZ enzymes

Abstract

Mikroorganismer i jord utfordres av forskjellige miljøforhold. Både biotiske og abiotiske faktorer (eksempelvis respirasjon, vanning av jord eller nedbør) fører til endringer mellom oksiske og anoksiske forhold. Disse endringene i oksygenkonsentrasjon kan gi opphav til reaktive oksygenarter (ROS), som videre kan føre til oksidativt stress i mikroorganismene. Denitrifiserende bakterier, som kan respirere anaerobt ved reduksjon av nitrat til nitrogen via nitritt, nitrogenmonoksid (NO) og dinitrogenoksid, lever i slike miljøer og er dermed utsatt for de skadelige effektene av ROS. Innvirkningen av ROS på denitrifikasjonsproteinene er lite utforsket, men det er indikasjoner for at enzymene nitritt reduktase (NirS/NirK) og dinitrogenoksid reduktase (NosZ) er mest påvirket. Målet med denne avhandlingen var å undersøke hvordan oksidativt stress fra hydrogenperoksid (H2O2) og nitrosativt stress fra NO påvirker enzymene NirS/NirK og NosZ hos to fullverdige denitrifiserende bakterier, Bradyrhizobium japonicum og Pseudomonas stutzeri, in vitro og in vivo. Gjennom et robotisert inkubasjonssystem ble gasskinetikk målt for å vurdere hvordan vekst og denitrifikasjonsrate ble påvirket av oksidativt stress. Innvirkningen av nitrosativt og oksidativt stress på NirS/NirK og NosZ sin enzymaktivitet ble analysert ved bruk av viologen assay og proteomikk. Resultatene viste betydelig reduksjon i denitrifikasjon, som påvirket NosZ mer enn NirS/NirK. Nitrosativt stress hadde større negativ effekt på enzymaktiviteten sammenlignet med oksidativt stress. Funnene viser sårbarheten til denitrifiserende enzymer for oksidativt og nitrosativt stress, som kan påvirke nitrogenkretsløpet i jorden. Videre undersøkelser av hvordan stresset påvirker det aktive sete til NirS/NirK og NosZ kan gi dypere forståelse for hvilke skader som fører til redusert aktivitet.

Microorganisms in soil are exposed to challenges by changing environmental conditions. Both biotic and abiotic factors (e.g. respiration, watering of soils or rainfall). Introduce alternations between oxic and anoxic conditions, which induce oxidative stress on the microorganisms through fluctuations of oxygen, giving rise to reactive oxygen species (ROS). ROS react locally in the cell and can have detrimental effects on denitrification, an anaerobic respiration of nitrate/nitrite to dinitrogen gas, which is the most energetically favorable respiration in the absence of oxygen. The impact of ROS on denitrifiers and their denitrification proteome remains understudied. With some evidence suggesting that, denitrifying enzymes nitrite reductase (NirS/NirK) and nitrous oxide reductase (NosZ) are most affected. The aim of this study was to investigate how oxidative stress by hydrogen peroxide (H2O2) and nitrosative stress by nitric oxide (NO), affect NirS/NirK and NosZ enzymes of two full-fledged denitrifiers Bradyrhizobium japonicum and Pseudomonas stutzeri, in vitro and in vivo. Using a robotized incubation system, gas kinetics were measured to assess how growth and denitrification were affected by oxidative stress. The impact of nitrosative and oxidative stress on NirS/NirK and NosZ enzyme activities, was analyzed using viologen activity assay and proteomics. The results showed significant reduction in denitrification, affecting the NosZ enzyme more than NirS/NirK. With NO leading to lower enzyme activity than H2O2. The findings highlight the vulnerability of denitrification enzymes to oxidative and nitrosative stress, which could potentially influence nitrogen cycling in the soil. Further investigation into how the stress affects the active sites of Nir and NosZ could provide deeper understandings to what damages leads to reduced activity.