Exploring bovine enteroids as an in vitro infection model for Cryptosporidium parvum

Abstract

Cryptosporidium spp. er en apikompleks verdensomspennende endoparasitt med et bredt vertspekter. Den gir cryptosporidiosis, en gastrointestinal sykdom som særlig nyfødte og unge virveldyr er sårbare for og den kan utgjøre en trussel mot de som har svakt imunsystem. Denne parasitten er også ofte assosiert med vannbårne utbrudd. Cryptosporidium parvum er arten som infiserer nyfødte kalver og den forårsaker betydelige økonomiske tap for kvegindustrien samt velferdsproblemer for de infiserte kalvene. Fra et En Helse -perspektiv er C. parvum en viktig patogen siden den er den mest vanlige zoonotiske arten. Det er svært få behandlingsalternativer både for kyr og mennesker, og de kommer til kort for å fjerne infeksjonen, samt kan de ikke benyttes av de med svakt immunforsvar

En flaskehals i forskningen på denne parasitten har vært mangelen på egnete in vitro modeller for å fullføre dens livssyklus og studere vert-patogen-interaksjoner. I løpet av de siste årene har den eksplosive utviklingen av organoider, mini-organer, åpnet nye muligheter for å knekke koden for infeksjon og reproduksjon in vitro for denne parasitten. Organoider har også potensial til å bidra til å redusere behovet for dyreforsøk hvis de kan brukes som erstatninger for å utforske patogen-reproduksjon. I denne studien har bovine enteroider (tarmorganoider) blitt utforsket som en potensiell infeksjonsmodell for C. parvum. Målene med studien var å (i) isolere og kultivere bovine enteroider, (ii) karakterisere deres cellepopulasjoner og (iii) manipulere og studere egnetheten til bovine enteroider som modell for infeksjon med Cryptosporidium parvum.

Bovine intestinale krypter ble isolert fra kalver planlagt for eutanasi, av årsaker som ikke var relatert til dette prosjektet, og dyrket i et basalmembranekstrakt og IntestiCult-media med tilsetninger. Tre isolater; A, X, og I, ble inkludert i eksperimentene i denne studien. Omtrent en gang i uken ble enteroidene passert, noe som betyr at de ble brutt ned til kryptceller og sådd på ny for å oppformere dem. Enteroidene ble utsatt for immunofluorescensfarging med markører for stamceller, enteroendokrine celler, cellekjerner og cytoskjelett for karakterisering av cellepopulasjonen på ulike tidspunkter etter passasje og ved ulike passasjer.

Enteroidene ble manipulert for å oppnå apikal ut konfigurasjon, som er en eksperimentelt protokoll rettet mot å gjøre enteroidene mottakelige for infeksjon med C. parvum. Dette ble gjort ved å mekanisk bryte ned enteroidene og utsatte dem for enzymatisk fordøyelse og suspensjon i IntestiCult: Advanced DMEM/F12, hvor de ville reversere sin polaritet over 2-3 dager i denne suspensjonen. Infeksjonen fant sted 3 dager etter at enteroidene ble behandlet for manipulasjon for apikal ut konfigurasjon. Prøvene ble høstet ved 1 time post-infeksjon (hpi), 48hpi og 96hpi og kjørt med qPCR for å kvantifisere 18s DNA av C. parvum og farget for parasittdeteksjon.

Generelt var dyrkingen av bovine enteroider vellykket, og isolat A ble passert 63 ganger, noe som langt overstiger antall passasjer som tidligere er rapportert for bovine enteroider. Det var mulig å fastslå at enteroidene hadde enteroendokrine celler og stamceller som en del av deres cellepopulasjoner, og vekstmønsteret til enteroidene lignet tidligere publiserte studier på andre bovine enteroider fra andre publikasjoner. Manipuleringsteknikken for å reversere enteroide-polariteten til apikal ut konfigurasjon var vellykket.

Ved qPCR ble det påvist en statistisk signifikant økning av parasitt-DNA i infeksjonseksperimentene med isolat I (p < 0.0001), men ikke for isolat A og X. Parasitter ble også sannsynligvis påvist i infeksjonstester for isolat A via immunofluorescensfarging. Imidlertid var det ikke mulig å påvise noen oocyster, den siste fasen av Cryptosporidium parvums livssyklus, noe som indikerer at vi kanskje bare har delvis lyktes med spredning av parasitten i denne in vitro-infeksjonsmodellen.

Funnene fra denne studien viser at isolering, dyrking, kryopreservering og gjenoppliving av bovinavledede enteroider er mulig, og at de morfologisk ligner tidligere beskrevne bovine enteroider. Videre har studien avdekket noen utfordringer med apikal ut tilnærmingen for patogen-vert-studier. Til slutt belyser studien utfordringene med å oppdage livssyklusstadiene til C. parvum i denne in vitro-modellen, men gir noen indikasjoner på hvordan denne modellen kan forbedres for å forhåpentligvis støtte fullstendig utvikling av C. parvum.

Cryptosporidium spp. is an apicomplexan cosmopolitan endoparasite with a wide host range. It causes cryptosporidiosis, a gastrointestinal disease of which particularly neonatal and young vertebrates are susceptible to and can pose a threat to those who are immunocompromised. This parasite is also frequently associated with waterborne outbreaks. Cryptosporidium parvum is the species infective to neonatal calves and causes impactful economical losses to the cattle industry as well as causing welfare issues for the cales infected. From a one health perspective, C. parvum is an important pathogen as it is the most commonly zoonotic species. There are very few treatment options both for cattle and humans, and they are insufficient in clearing the disease as well as being unsuitable for immunocompromised patients.

A bottleneck in the research of this parasite has been the lack of suitable in vitro models to complete its life cycle and study host-pathogen interactions. In recent years the booming development of organoids, mini organs, has opened new possibilities for cracking the code of infection and propagation in vitro for this parasite. Organoids also holds promise to help decrease the need for animal experiments if they can be used as substitutes for exploring pathogen propagation. In this study, bovine derived enteroids (intestinal organoids) have been explored as a potential infection model for C. parvum. The aims of the study were to (i) isolate and culture bovine enteroids, (ii) characterize their cell populations and (iii) manipulate and study the suitability of bovine enteroids as a model for infection with Cryptosporidium parvum.

Bovine intestinal crypts were isolated from calves scheduled for euthanasia, for reasons unrelated to this project, and cultured in a basement membrane extract and IntestiCult media with supplements. Three isolates; A, X, and I were included in the experiments of this study. Approximately once a week the enteroids were passaged, meaning they were broken down into crypt cells and re-seed to amplify them. The enteroids were subjected to immunofluorescence staining experiments with markers for stem cells, enteroendocrine cells, cell nuclei and cytoskeleton for characterisation of the cell population at different timepoints after passage and at different passages.

The enteroids were manipulated to achieve apical out configuration, which is an experimental protocol aimed at making the enteroids susceptible for infection with C. parvum. This was done by breaking the enteroids down mechanically and subjecting them to enzymatic digestion and suspending them in IntestiCult: Advanced DMEM/F12 and they would reverse their polarity over 2-3 days staying in this suspension. The infection took place 3 days after the enteroids were treated for manipulation for apical out configuration. The samples were harvested at 1hpi, 48hi and 96hpi and processed with qPCR to quantify 18s DNA of C. parvum and stained for parasite detection.

Overall, the culturing of bovine enteroids was successful, l and isolate A was subjected to 63 passages, greatly exceeding passage number previously reported for bovine enteroids. It was possible to determine that the enteroids had enteroendocrine cells and stem cells as part of their cell populations and the growth pattern of the enteroids resembled previously published studies on other bovine enteroids from other publications. The manipulation technique of reversing the enteroid polarity to apical out configuration was successful.

By qPCR, a statistically significant increase of parasite DNA in the infection challenges with isolate I (p < 0.0001) was detected but not for Isolate A and X. Parasites were also most likely detected in infection trials for isolate A via immunofluorescence staining. However, it was not possible to detect any oocysts, the last stage of Cryptosporidium parvums life cycle, indicating that we may only have partially succeeded with the propagation of the parasite in this in vitro infection model.

The findings from this study shows that isolation, culturing, cryopreservation, and resuscitation of bovine derived enteroids is possible and that they morphologically resemble previously described bovine enteroids. Furthermore, the study has revealed some challenges with the apical out approach for pathogen-host studies. Lastly, the study highlights challenges of assessing the life cycle stages of C. parvum in this in vitro model but offer some indications to how this model could be improved to hopefully support the complete development of C. parvum.