Exploring food-derived bioactives through ex vivo digestion, peptidomic profiling and in silico modelling

Abstract

Food bioactives are defined as substances in food that interact with human biological processes, affecting body functions or conditions and ultimately health. Bioactive peptides (BAPs) deriving from dietary proteins can, depending on their bioavailability, circulate in the blood stream to reach target organs, exerting systemic effects, that influence disease development, in terms of both beneficial and adverse outcomes. This thesis focused on exploring bioactive peptides from milk, wheat, faba beans and peas through ex vivo digestion, peptidomic profiling and in silico modelling. The core areas, bioavailability, bioaccessibility and bioactive potential were explored.

Milk β-casomorphin-7 (BCM7) is a heptapeptide deriving from bovine β-casein. Earlier research claim that the release of BCM7 during gastrointestinal (GI) digestion is restricted to the A1 genetic variant of β-casein. This peptide has an opioid-like structure and has been implicated in influencing digestive processes and potentially impacting neurological functions, among others. In Paper 1, the effect of β-casein genetic variants on the release of BCM7 during ex vivo GI digestion with human enzymes was investigated. It was found that genetic variation affected hydrolysis of β-casein and the release of BCM7, but the release was not solely linked to the A1 variant as previously suggested. In Paper 2, the investigation expanded to include several β-casein variants (A1, A2, F, and I) and quantified BCM7 release after ex vivo GI digestion of milk. This confirmed the results obtained on digestion of purified β- casein, Paper 1, although larger differences in BCM7 release between variant A1 and A2 were observed. However, all milks released BCM7 after ex vivo GI digestion. Focusing on exploring bioaccessibility of BCM7, the work in Paper 3 monitored the peptide through ex vivo GI digestion and porcine jejunal brush border membrane digestion. It was found that more than 40% of BCM7 was degraded after 2h brush border membrane digestion, and only 5% remained intact after 24h. This questions the bioactivity and potential health impacts of BCM7 and its fragments.

Wheat-related disorders is increasing globally, and the extensive breeding of modern wheat varieties has been implicated. Ancestral wheat species such as einkorn, emmer and spelt, has undergone minimal changes during domestication of wheat, and are believed to contain lower levels of components triggering wheat disorders. Therefore, in Paper 4, different wheat types (common and ancestral) were compared regarding release of T cell epitope-containing immunogenic peptides following ex vivo digestion. The immunodominant peptides of gliadins (33mer, 25mer and 26mer) were not found in their intact form in any of the wheat digesta, but as degraded fragments. Additionally, the ancestral wheat types released fewer immunogenic peptides than common wheat varieties. In Paper 6, the peptidomic profile was investigated for the identification of potential opioids. The ex vivo digestion resulted in release of fewer opioid-containing peptide sequences in einkorn (n=6) and spelt (n=5), compared to the modern wheat varieties Bastian (n=24) and Mirakel (n=26), suggesting differences in opioid potential between ancestral and common wheat types. Although the ancestral wheat types still pose a risk and thus cannot be considered safe for celiac patients, their lower content of immunogenic and opioidcontaining peptides indicates that they may trigger weaker sensitivity reactions and could possibly reduce onset of celiac disease in genetically predisposed individuals.

Legumes remain underutilized in the western diet despite their status as nutritional and sustainable protein sources. They also hold potential as sources of BAPs, but research is still limited, particularly regarding their bioavailability, bioaccessibility and bioactivity during physiological relevant human digestion. The work presented in Paper 5, aimed at exploring the bioactive potential of faba beans and peas, where protein-enriched fractions of these legumes were subjected to ex vivo GI digestion. Over 400 unique peptides were identified following ex vivo digestion. Through in silico approach, peptide candidates were selected and tested for their immunemodulating properties in an in vitro cell model. Both pea- and faba bean-derived peptides showed to significantly decrease inflammatory response in Caco-2 cells, suggesting immune-modulating properties. Also, the in silico approach identified several hundred BAPs encrypted within the digesta of pea and faba bean, as well as peptide sequences with homology (>90%) to several known allergenic epitopes in the Fabaceae family. This work highlights the potential of legumes as a health-promoting food source and the advantages of combining in vitro, ex vivo and in silico approaches to explore bioactive potential of legumes, for which extensive evidence is still lacking.

While most research has highlighted BAPs beneficial effects, this thesis has emphasized investigation of BAPs with potential adverse effects. Still, controlled clinical trials are needed to ascertain any health impacts of these BAPs. Nevertheless, the combined methodological approach herein shows great potential and should be exploited in future food bioactive research and could be extended to pharmacological research.

Bioaktive komponenter i mat defineres som aktive stoffer som påvirker ulike biologiske prosesser i kroppen etter matinntak og kan således ha effekt på helsen. Bioaktive peptider (BAP) frigjøres fra proteiner etter fordøyelse, og vil dersom de er biotilgjengelige, overføres fra tarmen til blodbanen og påvirke ulike organer som kan ha både positiv og negativ innvirkning på sykdomsforløp. Denne avhandlingen utforsket bioaktive peptider fra melk, ulike hvete sorter, faba-bønner og erter, ved å benytte en ex vivo gastrointestinal (GI) fordøyelsesmodell med humane enzymer. Itillegg ble peptidomisk profileringsmetode og in silico modellering anvendt for å undersøke peptidenes biotilgjengelighet og bioaktive potensiale.

β-casomorfin-7 (BCM7) er et heptapeptid som kan dannes når proteinet β-kasein (β- CN) i melk brytes ned under fordøyelse. Tidligere forskning har vist at BCM7 kun frigjøres under fordøyelse av genetisk variant A1 av β-CN. Dette peptidet har en opioidlignende struktur og kan blant annet påvirke fordøyelsesprosesser og nevrologiske funksjoner. I Artikkel 1 ble effekt av genetisk variant av β-CN vurdert mot frigjøring av BCM7 under ex vivo GI fordøyelse. Genetisk variant påvirket grad av nedbryting av β-CN og hvor raskt BCM7 ble dannet, men frigjøring av BCM7 var ikke begrenset til kun A1-varianten som tidligere påstått, da BCM7 også ble identifisert fra A2 varianten. I forsøket omtalt i Artikkel 2 ble flere varianter av β-CN (A1, A2, F og I) inkludert, og mengde BCM7 som ble dannet etter ex vivo GI fordøyelse av melk analysert. Dette forsøket bekreftet resultatene fra fordøyelse av renset β-kasein i Artikkel 1, men her ble det funnet større forskjeller i mengde BCM7 frigjort fra variant A1 sammenlignet med variant A2. BCM7 ble dannet etter ex vivo GI fordøyelse av alle de fire variantene av β-CN. I Artikkel 3 ble stabilitet og eventuell videre nedbryting av BCM7 undersøkt under ex vivo GI fordøyelse etterfulgt av enzymer isolert fra børstesømmembraner i tolvfingertarm hos gris. Mer enn 40 % av BCM7 ble brutt ned etter 2 timer børstesøm-fordøyelse, og kun 5 % var intakt etter 24 timer. Dette stiller spørsmål ved bioaktivitet og mulige helseeffekter av BCM7, siden det spaltes videre til mindre fragmenter.

Det er en global økning i ulike tarmlidelser relatert til inntak av hvete, noe som kan være knyttet til moderne hveteforedling. Urhvete er ikke foredlet i samme grad og antas å inneholde lavere nivåer av komponenter som utløser hvete-sensitivitet. I Artikkel 4 ble immunogene peptider som kan binde til T-celler identifisert etter ex vivo fordøyelse av urhvete og moderne hvetetyper. De mest kjente immundominante peptidene fra gliadiner (33mer, 25mer og 26mer) ble ikke funnet intakte, men som nedbrutte fragmenter. I tillegg frigjorde urhvete færre immunogene peptider enn moderne hvetesorter. I Artikkel 6 ble potensielle opioider undersøkt etter ex vivo fordøyelse av de samme hvetesortene. Det ble identifisert færre opioide peptidsekvenser i einkorn (n=6) og spelt (n=5), sammenlignet med de moderne sortene Bastian (n=24) og Mirakel (n=26). Dette tyder på at foredling kan ha tilført opioid potensiale til hvete. Selv om de gamle hvetetypene fortsatt utgjør en risiko og dermed ikke kan anses som trygge for cøliakere, indikerer lavere innhold av immunogene og opioide peptider at de kan utløse svakere sensitivitetsreaksjoner og muligens redusere utvikling av cøliaki hos genetisk disponerte individer.

Til tross for at belgfrukter er næringsrike og bærekraftige kilder til protein, er de fortsatt lite benyttet i vårt kosthold. De kan også være kilder til bioaktive peptider, men forskningen er begrenset, spesielt med hensyn til å kunne påvise biotilgjengelighet og bioaktivitet i kroppen. Arbeidet presentert i Artikkel 5, hadde som mål å undersøke biotilgjengelighet og det bioaktive potensialet til faba-bønner og erter ved hjelp av ex vivo og in silico modeller. Etter ex vivo GI fordøyelse av proteinrike fraksjoner ble over 400 unike peptider identifisert. In silico-modellering ble benyttet til å velge peptider med bioaktivt potensiale, og immunmodulerende egenskaper til utvalgte peptider ble testet i en in vitro cellemodell. Både peptider fra erter og faba-bønner viste signifikant reduksjon i inflammatorisk respons i Caco-2-celler, noe som tyder på immunmodulerende egenskaper. I tillegg avdekket in silico-modellering flere hundre bioaktive peptider som sekvenser i større peptider av både erter og faba-bønner etter fordøyelse. Det ble også funnet peptidsekvenser med høy grad av likhet (>90 %) med flere kjente allergen epitoper fra proteiner i fabaceae-familien. Dette arbeidet viser potensialet til belgfrukter som en helsefremmende matkilde, i tillegg til fordelene med å kombinere in vitro, ex vivo og in silico undersøkelser for å utforske deres bioaktive potensiale, som det fortsatt mangler omfattende bevis for.

Selv om flest studier har fremhevet positive helseeffekter av bioaktive peptider, har denne avhandlingen lagt vekt på å undersøke bioaktive peptider med mulige negative effekter. Kontrollerte kliniske studier er fortsatt nødvendige for å fastslå eventuelle helseeffekter av disse peptidene. Likevel viser den kombinerte metodiske tilnærmingen her stort potensiale og anbefales for fremtidig forskning på bioaktive komponenter i mat, og kan ytterligere utvides til andre fagområder slik som farmakologisk forskning.