Modifying cellulose fibers with lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs)

Abstract

This PhD thesis encompasses studies of how lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) may be used for enzymatic modification and functionalization of cellulose for the development of renewable biomaterials. The thesis is structured around four research papers, each contributing to the understanding of LPMOs and their possible roles in cellulose fiber modification. Paper I delves into the catalytic performance and fiber modification potential of eleven fungal AA9-type LPMOs, including variants with and without CBM1 carbohydrate-binding modules (CBMs). This study explores the activity of these enzymes on cellulosic substrates with varying crystallinity and polymer chain arrangements, namely Cellulose I, Cellulose II, and amorphous cellulose (PASC). The results demonstrate substantial functional variation among LPMOs in terms of which cellulosic substrates they act on and the possible contributions of CBMs. Paper II describes an innovative analytical method designed for in-depth characterization of inhomogeneous, layered cellulose fiber structures. This novel method, based on sequential limited dissolution of labeled fiber layers and subsequent size exclusion chromatography with multi-angle light scattering, fluorescence labeling, and refractive index ( SEC-MALS-FL-RI) analysis, for detecting the molecular weight distribution of dissolved fibers, enables timeresolved detailed profiling of LPMO-catalyzed cleavages at different depths in the cellulose fiber. When tested on LPMO-treated Whatman cellulose fibers, the method revealed the extent of fiber modification by the enzyme, from the fiber surface to the fiber core, thus providing novel insight into enzymatic fiber modification. The work described in Paper III assesses the influence of the CBM1 domain in a family AA9 LPMO from Neurospora crassa called NcAA9C on LPMO performance in fiber engineering. The results show that the impact of the CBM1 on substrate binding varies for different forms of celluloses. Use of the method described in Paper II showed that cuts by the CBM-free enzyme are more evenly spread through the fiber compared to the CBM-containing full-length enzyme and showed that the truncated enzyme can penetrate deeper into the fiber. Thus, the capability of LPMOs to modify cellulose fibers from surface to core depends on enzyme modularity, meaning that such modularity affects the properties of the produced, partially oxidized cellulose fibers. Paper IV explores the possibility of oxidizing cellulose fibers with LPMOs in a controlled manner, by sequential addition of defined amounts of reductant and hydrogen peroxide (H2O2) to the reaction mixture. The results show that the degree of fiber oxidation depends on the total amounts of reductant and H2O2 added to the reaction, but only when using stable reaction conditions, i.e. conditions in which enzyme inactivation is avoided. The properties of the resulting modified fibers, such as dispersity, vary between LPMOs, showing that the enzymes interact with cellulose in different manners (as also shown in Paper I). Importantly, a closer look at the product formation pattern showed rapid oxidation of cellulose fibers and limited fiber solubilization at lower overall dosages of the reductant and H2O2. At higher dosages, oxidation of the fibers levels off, while production of soluble oxidized oligosaccharides continues. Collectively, these studies not only enhance our understanding of LPMO functionality, including the interaction with various types of cellulose fibers, but also contribute significantly to the broader field of enzymebased biorefining. The present results offer new perspectives and methodologies that pave the way for future innovations in the development and characterization of renewable biomaterials.

Denne doktorgradsavhandlingen omhandler studier av hvordan lytisk polysakkarid monooksygenaser (LPMOer) kan brukes for enzymatisk modifisering og funksjonalisering av cellulose, med mål om å utvikle fornybare biomaterialer. Avhandlingen er strukturert rundt fire forskningsartikler, hvor hver bidrar til bedre forståelse av LPMOenes potensielle roller i modifisering av cellulosefibre. Artikkel I fordyper seg i den katalytiske ytelsen og potensialet for fibermodifisering av elleve AA9-type LPMOer, både med og uten CBM1 karbohydratbindende moduler (CBMer). Studien utforsker enzymenes aktivitet på cellulosesubstrater med varierende krystallinitetsnivåer og polymerkjedestrukturer, spesifikt Cellulose I, Cellulose II og amorf cellulose (PASC). Resultatene viser signifikante funksjonelle forskjeller mellom LPMOene i forhold til hvilke substrater de virker på, samt potensielle bidrag fra CBM-modulene. Artikkel II beskriver en ny analytisk metode utviklet for detaljert karakterisering av inhomogene, lagdelte strukturer av cellulosefibre. Denne metoden, som anvender sekvensiell begrenset oppløsning av merkede fiberlag fulgt av størrelseseksklusjonskromatografi med flervinklet lysspredning, fluorescensmerking, og brytningsindeksanalyse (SEC-MALS-FL-RI), for å detektere molekylær massefordeling av oppløste fibre, muliggjør tidsbestemt profilering av LPMO-katalyserte spaltninger på forskjellige dybder i cellulosefibrene. Da metoden ble anvendt på Whatman-cellulosefibre behandlet med LPMO, ble enzymets omfattende modifiseringsevne fra fiberoverflaten til kjernen kartlagt, noe som tilfører ny innsikt i enzymatisk fibermodifisering. I Artikkel III vurderes effekten av CBM1-domenet i en AA9 LPMO fra Neurospora crassa, kjent som NcAA9C, på enzymets ytelse i fibermodifisering. Resultatene indikerer at CBM1s innflytelse på substratbinding varierer for ulike former av cellulose. Bruk av metoden beskrevet i Artikkel II demonstrerer at spaltninger utført av det CBM-frie enzymet fordeler seg jevnere gjennom fiberen sammenlignet med det komplette CBM-inneholdende enzymet, og viser at det trunkerte enzymet kan trenge dypere inn i fiberen. Dette underbygger at LPMOenes evne til å modifisere cellulosefibre fra overflate til kjerne avhenger av enzymets modularitet, hvilket påvirker egenskapene til de delvis oksiderte cellulosefibrene som produseres. Artikkel IV utforsker mulighetene for kontrollert oksidasjon av cellulosefibre med LPMOer gjennom sekvensiell tilsetning av definerte mengder reduktant og hydrogenperoksid (H2O2) til reaksjonsblandingen. Resultatene viser at graden av fiberoksidasjon avhenger av de samlede mengdene av reduktant og H2O2 som tilsettes, og at dette kun oppnås under stabile reaksjonsforhold der enzyminaktivering unngås. Egenskapene til de resulterende fiberne, bl.a. dispersitet, varierer mellom ulike LPMOer, noe som bekrefter at enzymene interagerer forskjellig med cellulosen (som også ble observert i Artikkel I). En nærmere undersøkelse av mønsteret for produktdannelse viser at cellulosefibrene oksideres raskt og at fiberoppløseligheten er begrenset ved lavere totale doser av reduksjonsmiddelet og H2O2. Ved høyere doser stabiliseres oksidasjonen av fibrene, mens dannelsen av løselige oksiderte oligosakkarider fortsetter. Samlet sett bidrar disse studiene til bedre forståelse av LPMO-funksjonaliteten, inkludert deres interaksjon med forskjellige typer cellulosefibre, i tillegg til å bidra vesentlig til det bredere feltet av enzymbasert bioraffinering. De nåværende resultatene presenterer nye perspektiver og metoder som legger til rette for fremtidige innovasjoner i utviklingen og karakteriseringen av fornybare biomaterialer