Inflammatory conditions in the musculoskeletal system of salmonids in Norwegian aquaculture in relation to melanized changes

Abstract

Norwegian salmonid aquaculture has become one of Norway's largest industries. With a yearly export of 1.25 million tons, Norway is the largest producer of Atlantic salmon worldwide. Norway also has a significant production of farmed rainbow trout. The production procedures for the two species are relatively similar, with both freshwater and seawater phases due to the anadromous lifestyles of the species. During the last forty years, production has developed into a highly intensified industry, with a production time frame of about two years. To accommodate the rapid production, several improvements in fish health have emerged. An important part of the production is the selective breeding of fast-growing, slow-maturing individuals with increased robustness against diseases. Additionally, the development of efficient vaccines against several infectious agents has resulted in a significant increase in fish health and welfare and a decrease in the use of antibiotics to treat bacterial diseases. The impact of nutritional contents in fish feeds, such as lipid sources and minerals, has been given increasing attention over the last decades, as the feed can severely impact fish growth and general health. While the aquaculture industry has made significant strides in addressing potential hazards impacting farmed fish, some challenges continue to impact fish health and welfare. An important quality concern for the salmon industry is the occurrence of red and melanized changes in the skeletal muscle, commonly known as red focal changes (RFC) or melanized focal changes (MFC). These changes are predominantly detected in the abdominal wall's cranioventral region at slaughter; on average, 20-30 % of farmed Atlantic salmon are affected. The finding of RFC and MFC leads to cassation of the affected area in the fillet, costing the industry great economic losses each year. As these changes cannot be detected before slaughter, i.e., no detectable symptoms, they are primarily considered a quality concern; however, RFC and MFC cause significant tissue damage in the white muscle and could thus be considered an animal welfare problem. RFC and MFC represent acute and chronic inflammatory reactions in the skeletal muscle. Histological properties of RFC include hemorrhages and necrotic myocytes, while MFC is characterized by granulomatous inflammation, extensive fibrosis, and an abundance of melano-macrophages, the latter being responsible for the dark pigmentation of the fillet. The development from acute to chronic inflammation is suggested to result from persistent infection with piscine orthoreovirus 1 (PRV-1), as the virus has been found in relation to severe MFC and particularly to organized granulomas in the lesioned tissue. However, there is no indication that PRV-1 is the causative factor for the development of RFC, and the initial cause of the acute inflammation is not yet known. The specific localization of the changes has led to several theories on initiating factors causing focal hemorrhage and necrosis in the skeletal muscle, such as intraperitoneal (i.p.) vaccine injections, external trauma causing bruises to the muscle or inflicting fractures on the ribs, or extension of the stomach due to extensive feeding with pellets causing pressure on the abdominal wall. Some production parameters have proved to reduce the prevalence of RFC and MFC, such as increased fish oil content in the feeds, consequently increasing the level of the anti-inflammatory fatty acids eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA). RFC and MFC have not been observed in wild-living Atlantic salmon, and the prevalence of RFC and MFC in farmed rainbow trout and in organically farmed Atlantic salmon are believed to be lower than in common Atlantic salmon production. This has led to the question of whether the prevalence in conventional Atlantic salmon farming is due to the external factors revolving around the production procedures or if the internal (genetic) dissimilarities between farmed and wild salmon and between salmon and rainbow trout can have an impact on the development of RFC and MFC. This thesis aimed to address critical questions about RFC and MFC's origins in Norwegian salmonid production. In paper I, the association between pathological conditions in the ribs in relation to RFC and MFC was investigated, as their anatomical location could indicate involvement in the development of RFC/MFC. Here, Atlantic salmon from a commercial producer, Bremnes Seashore AS, experimentally kept fish from Matre Research station, and wild-caught spawning salmon were investigated using radiography and histology for costal abnormalities in relation to RFC and MFC. The results showed an association between costal fractures and RFC and MFC and between callus formations and MFC. However, RFC and MFC were also observed with no pathological changes in the ribs. The histological investigations described the anatomical properties of Atlantic salmon ribs, including vascularization of the ribs, giving further insight into the pathogenesis during costal fractures in salmon and the association to RFC and MFC. Although most commonly seen as focal discoloration in the cranio-ventral abdominal wall, melanization has been observed in other parts of the skeletal muscle with lower frequency. Different locations and distributions may indicate a different cause and development. In paper II, a morphological description was conducted on diffuse melanization of red skeletal muscle in farmed Atlantic salmon, a condition rarely observed partially due to the retainment of the skin during slaughter. The red skeletal muscle is located right beneath the skin, on the lateral sides of the truncus, and makes up less than 10% of the total skeletal mass in salmonids. Red skeletal muscle's physiological properties differ from white skeletal muscle's, with smaller myocytes, abundant vascularization, and aerobic metabolism. Additionally, during disease outbreaks of heart and skeletal muscle inflammation (HSMI) or pancreas disease (PD) caused by PRV-1 and salmonid alphavirus (SAV), respectively, lesions are predominantly found in the red skeletal muscle and, to a lesser degree, in the white skeletal muscle. The results in paper II showed similar changes as in MFC in the abdominal wall, with diffuse granulomatous inflammation and extensive fibrosis and infiltration of melano-macrophages. No organized granulomas were present. Using reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), PRV-1 was detected, with a statistically significant lower Ct value in the affected samples. The specific location of the virus in the tissue was not investigated; however, the characteristics of the lesions corresponded with a persistent infection of PRV-1, although without granulomas, as seen in advanced high-grade MFC in white skeletal muscle. To determine whether the differing occurrence of RFC and MFC in farmed and wild Atlantic salmon arises from external influences or genetic factors, a study was conducted in which Atlantic salmon from farmed, wild, and hybrid backgrounds were raised under identical rearing conditions from hatching until slaughter (paper III). The prevalence of the changes was investigated before and after seawater transfer. In accordance with earlier reports, RFC and MFC occurred in the seawater phase. RFC remained stable at 1-5 % throughout the trial, whereas MFC increased towards slaughter, reaching a 25-30 % prevalence. There was no significant difference in prevalence across the origin groups, and histological investigations revealed similar changes in both farmed, wild, and hybrid fish. These results indicate that the changes develop due to external production-related factors and thus explain the absence of RFC and MFC in wild-living Atlantic salmon. The variation in prevalence seen in farmed rainbow trout has also been hypothesized to result from genetic differences, especially given the similar rearing conditions shared with Atlantic salmon production. To provide novel information on the frequency and morphological characteristics of RFC and MFC in farmed rainbow trout, investigations were conducted on slaughter-ready fish from three different farm sites in Western Norway (paper IV). RFC was only detected in one fish, whereas MFC had a maximum prevalence of 6.47%. Histological investigations revealed some similarities to those found in Atlantic salmon, however, with a lower presence of melano-macrophages and other inflammatory cells embedded in the lesioned and fibrotic tissue. Importantly, organized granulomas were only detected in one fish. PRV-1 and SAV were detected in skeletal muscle with RT-qPCR, and in situ hybridization (ISH) revealed that the viruses were not located in relation to the lesions, in contrast to PRV-1 in severe melanized changes in Atlantic salmon. These results indicate that the response and clearance of viruses are dissimilar and more efficient in rainbow trout, in accordance with earlier comparative reports on viral-specific responses, possibly explaining the lower prevalence of MFC in rainbow trout. Thus, the dissimilar frequency of MFC in farmed Atlantic salmon and rainbow trout is likely due to genetic divergencies between the two species. Additionally, the lower prevalence of RFC in rainbow trout indicates a lower impact of an external factor than in Atlantic salmon production, causing local hemorrhage and necrosis. In sum, this thesis sheds light on the initial factors causing RFC and MFC in farmed Atlantic salmon and rainbow trout. The results emphasize the high significance of external factors and the low influence of genetic impact on the prevalence of focal changes in farmed Atlantic salmon and pinpoint costal fractures as one possible external factor that can cause RFC and MFC. Novel insight into the anatomical properties of Atlantic salmon ribs was revealed, providing essential information for future analyses of pathological changes in the ribs and adjacent soft tissue. Different distributions of melanization in Atlantic salmon may have different causes, such as diffuse melanization of the red skeletal muscle. However, the severity and duration of the chronic inflammation are suggested to result from the persistent infection of PRV-1, regardless of distribution. This thesis provides the first description of RFC and MFC in farmed rainbow trout. The findings imply that the lower prevalence of MFC in rainbow trout results from genetic divergencies between the two species, causing different viral defenses and elimination. Additionally, external factors may inflict less harm on farmed rainbow trout than Atlantic salmon, as the prevalence of RFC was also lower.

Norsk lakseproduksjon utgjør i dag en av Norges største industrier, og med en årlig eksport på 1.25 millioner tonn er Norge verdens største produsent av atlantisk laks. Norge har også en betydelig produksjon av regnbueørret. Produksjonen av disse artene er tilnærmet like, med både ferskvannsfase og sjøvannsfase, hvor utgangspunktet er de anadrome egenskapene til artene. Denne industrien har i løpet av de siste årene blitt svært intensivert, med en produksjonssyklus på rundt 2 år. Flere tilpasninger er gjort innen fiskehelse for å best kunne imøtekomme denne hurtige produksjonen. En viktig del av dette arbeidet er seleksjonsbasert avl av rasktvoksende individ med sen seksuell modning og økt robusthet mot infeksjonssykdommer. I tillegg har utviklingen av effektive vaksiner resultert i betydelig forbedret fiskehelse og velferd, og ikke minst en kraftig nedgang i bruken av antibiotika ved behandling av bakterielle sykdommer. De senere årene har også fokuset på næringskomponenter i fiskefôret økt, som mineral- og lipidinnhold, da det viser seg at fôret har stor betydning for fiskens vekst og helse. På tross av store forbedringer innen laksens helse og velferd i oppdrettsnæringen er det fortsatt utfordringer knyttet til produksjonen. Et viktig kvalitetsproblem i næringen er forekomsten av røde og svarte flekker i den hvite skjelettmuskulaturen hos oppdrettslaks. Flekkene finnes hovedsakelig i den cranioventrale delen av bukveggen, og sees i gjennomsnitt i 20-30 % av fisken. Ved funn av slike flekker blir deler av, eller hele, fileten kassert, noe som fører til store økonomiske tap for næringen hvert år. Ettersom affisert fisk ikke viser symptomer blir ikke flekkene oppdaget før slakt, og dermed ansees dette hovedsakelig som et kvalitetsproblem. Fiskens velferd bør dog ikke ignoreres, ettersom de røde og svarte flekkene er et resultat av betydelig vevsskade i skjelettmuskulaturen. Røde og svarte flekker representerer henholdsvis en akutt og kronisk inflammasjonsreaksjon i skjelettmuskulaturen. Histologiske forandringer i røde flekker innebærer blødning og nekrose av muskelceller, mens det i svarte flekker foregår en kronisk, granulomatøs inflammasjon med uttalt fibrose, og med betydelig infiltrasjon av melanomakrofager som gir den distinkte mørke fargen i muskelvevet. Utviklingen fra akutt til kronisk inflammasjon skyldes trolig en persistent infeksjon av piscine orthoreovirus 1 (PRV-1). Dette viruset er sett i relasjon til alvorlige grader av svarte flekker hos atlantisk laks, og også i organiserte graulomer i vevet. Det er derimot ingen indikasjon på at PRV-1 er den utløsende årsaken til den akutte inflammasjonen. På grunn av sin spesifikke lokalisasjon i bukveggen har flere teorier blitt foreslått som årsak til de røde, og senere svarte, flekkene. Eksempler på slike teorier er både intraperitoneal (i.p.) vaksineinjeksjon, eksternt traume som gir skade på skjelettmuskulaturen eller ribbena, eller utvidelse av magesekken grunnet uttalt fôring med pellets som gir et innvendig trykk på bukveggen. Enkelte produksjonsparametere har dessuten vist seg å redusere forekomsten av røde og svarte flekker, som økt fiskeoljeinnhold i fôret, med påfølgende økt innhold av de anti-inflammatoriske fettsyrene eicosapentaensyre (EPA) og dokosaheksaensyre (DHA). Røde og svarte flekker er ikke observert i vill Atlantisk laks, og forekomsten av flekkene er trolig lavere i oppdrett av regnbueørret og økologisk laks. Dette har ført til spørsmålet om forekomsten av flekker hos konvensjonelt produsert laks skyldes eksterne faktorer i produksjonsprosedyrene, eller om det er interne (genetiske) forskjeller mellom oppdrettet og vill laks, og mellom atlantisk laks og regnbueørret, som er avgjørende for den ulike frekvensen av flekker. Denne doktorgradsavhandlingen adresserer viktige spørsmål rundt opphavet til de røde og svarte flekkene i norsk laksefiskproduksjon. I artikkel I ble assosiasjonen mellom røde og svarte flekker og patologiske forandringer i ribbena undersøkt, ettersom fiskens ribben ligger i nær relasjon til bukhulen og potensielt kan føre til skade i bukhulemuskulaturen. Ved hjelp av radiografiske og histologiske metoder ble prøver fra Atlantisk laks fra en konvensjonell oppdretter undersøkt, i tillegg til prøver fra Matre Forskningsstasjon og villfanget laks. Resultatet viste en sammenheng mellom ribbensfrakturer og røde og svarte flekker i skjelettmuskulaturen, samt en sammenheng mellom callusformasjoner i ribbena og svarte flekker. Røde og svarte flekker ble også observert uten patologiske forandringer på ribbena, som indikerte andre årsaksforhold enn ribbensforandringer. Gjennom histologiske undersøkelser ble anatomiske forhold i ribbena til Atlantisk laks beskrevet, inkludert vaskularisering av ribbena, noe som gir viktig kunnskap for patogenesen ved et ribbensbrudd, men som også understreker assosiasjonen til røde og svarte flekker. Selv om flekkene normalt sees som en fokal misfarging i den cranioventrale bukveggen, er melanisert skjelettmuskulatur også observert i andre deler av fisken, dog mer sjeldent. Ulik lokalisasjon og distribusjon av melaniseringen peker på andre utløsende årsaker og /eller ulik utvikling av inflammasjonen enn for de fokale flekkene. Artikkel II presenterer en morfologisk beskrivelse av diffus melanisering av den røde skjelettmuskulaturen i atlantisk laks, en tilstand som sjelden observeres, delvis fordi skinnet på fisken vanligvis ikke fjernes ved slakt. Den røde skjelettmuskulaturen utgjør under 10 % av den totale skjelettmuskelmassen i laksefisk. De fysiologiske egenskapene skiller seg fra den hvite skjelettmuskulaturen, med myocytter av mindre størrelse, uttalt vaskulering og aerob metabolisme. Dessuten, under utbrudd av hjerte- og skjelettmuskelbetennelse (HSMB) og pankreas sykdom (PD), forårsaket av henholdsvis PRV-1 og salmonid alphavirus (SAV), er det fortrinnsvis den røde skjelettmuskulaturen som affiseres, og i mindre grad den hvite. Resultatene i artikkel II viste lignende histologiske forandringer som er beskrevet i fokale svarte flekker, med diffus granulomatøs betennelse, uttalt fibrose og melanomakrofag-infiltrasjon. Organiserte granulomer ble ikke observert. Ved bruk av teknikken reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), ble PRV-1 detektert i muskelprøvene, med signifikant lavere Ct-verdi i de affiserte fiskene. Den spesifikke lokalisasjonen til viruset i vevet ble ikke avdekket, men lesjonenes karakteristikker korresponderte med den persistente PRV-1-infeksjonen som er vist i høygradige fokale svarte flekker. For å avdekke om den ulike forekomsten av flekker i oppdrettslaks og villaks skyldes eksterne eller genetiske faktorer, ble det i artikkel III gjennomført en studie hvor atlantisk laks med ulike opphav (avlet, vill og hybrid) ble holdt i identiske oppdrettsforhold fra klekking til slakt. Forekomsten av flekker ble undersøkt både i ferksvannsfasen og sjøvannsfasen. I samsvar med tidlige rapporter viste resultatene at flekkene oppstod i sjøvannsvasen av produksjonen. Forekomsten av røde flekker holdt seg stabil gjennom hele sjøvannsfasen, med en prevalens på 1-5%, mens de svarte flekkene økte i prevalens gjennom sjøvannsfasen, og ved slakt lå denne på 25-30 %. Det var ingen statistisk signifikant forskjell i prevalensen mellom de ulike opphavsgruppene, og histologiske undersøkelser viste lignende forandringer i alle gruppene. Disse resultatene indikerer at flekkene i oppdrettslaks oppstår som en konsekvens av eksterne faktorer i oppdrettsnæringen, noe som forklarer fraværet av flekker i villaks. Den ulike forekomsten av flekker hos oppdrettet regnbueørret har også ført til spekulasjoner om dette skyldes eksterne eller genetiske ulikheter mellom de to artene. Her er særlig den genetiske forskjellen foreslått, ettersom oppdrettsforholdene av artene er nærmest tilsvarende. Viktig informasjon om frekvensen og morfologien til flekker i regnbueørret ble presentert i artikkel IV, hvor slakteferdig regnbueørret fra tre ulike oppdrettsanlegg ble analysert. Røde flekker ble kun observert i én fisk, og den høyeste forekomsten av svarte flekker var 6,47%. Histologiske undersøkelser viste lignende forandringer som i atlantisk laks, men med lavere forekomst av infiltrerende melanomakrofager i det fibrotiske vevet. I tillegg ble det kun observert organiserte granulomer i en av fiskene. Både PRV-1 og SAV ble detektert i skjelettmuskelprøvene ved hjelp av RT-qPCR, og ved bruk av in situ hybridisering (ISH) ble det avdekket at virusene var lokalisert i områder uten lesjoner. Dette er i kontrast til høygradige svarte flekker hos atlantisk laks, hvor PRV-1 er assosiert med affiserte områder og organiserte granulomer. Disse resultatene indikerer ar responsen mot, og elimineringen av virus er ulik og mer effektiv i regnbueørret, noe som stemmer overens med publiserte resultater omhandlende komparativ virusrespons hos laksefisk. Dette er trolig også forklaringen på den lavere forekomsten av svarte flekker hos regnbueørret. Dermed er den ulike forekomsten av svarte flekker hos atlantisk laks og regnbueørret trolig grunnet genetiske ulikheter. Den lave forekomsten av røde flekker i regnbueørret indikerer dessuten at den utløsende, eksterne årsaken til flekker er av mindre betydning enn i oppdrett av atlantisk laks. For å konkludere omhandler denne avhandlingen utløsende faktorer for røde og svarte flekker i atlantisk laks og regnbueørret. Resultatene understreker betydningen av eksterne faktorer, og eliminerer betydningen av genetiske faktorer i forekomsten av flekker hos oppdrettslaks. Her vises det at ribbensfrakturer er en slik ekstern faktor som kan føre til utviklingen av flekker. Ny informasjon om anatomiske forhold i ribben hos atlantisk laks bidrar til viktig kunnskap ved tolkning av ribbensforandringer og patologiske endringer i det omkringliggende bløtvevet. Ulik distribusjon av melanisering i atlantisk laks kan ha ulike årsaker, som diffus melanisering av rød skjelettmuskulatur, men varigheten og alvorlighetsgraden er trolig et knyttet til en persistent infeksjon av PRV-1, uavhengig av distribusjon. Denne avhandlingen presenterer den første beskrivelsen av røde og svarte flekker i oppdrett av regnbueørret. Funnene viser at forekomsten av svarte flekker er lavere enn hos oppdrettslaks, og at dette trolig skyldes genetiske forskjeller mellom de to artene, som hovedsakelig resulterer i ulikt forsvar mot virusinfeksjon. Eksterne faktorer er trolig også av mindre betydning ved oppdrett av regnbueørret, ettersom forekomsten av røde flekker også var lavere her.