Pulmonary micrometastasis and immunological pre-metastatic niche in dogs with osteosarcoma

Abstract

Cancer is currently ranked as a leading cause of death in humans and dogs, most often due to metastatic disease. The pre-metastatic niche (PMN) represents the metastasis-supporting microenvironmental changes that occur in a distant target organ before metastasis. The primary tumour shapes the PMN in the metastatic target organ by releasing soluble factors and extracellular vesicles. PMN-formation is an essential step in metastatic development and drives organotropism. Osteosarcoma (OS) is the most common primary bone tumour in dogs and humans, with a high metastatic rate, despite a low metastatic prevalence at diagnosis. Although most dogs develop pulmonary metastases (>90%), the prevalence of micrometastases or PMN formation at diagnosis is unknown.

In this thesis, we assessed the prevalence of pulmonary micrometastases and PMN formation in dogs with OS without macroscopic metastases, focusing on macrophage and bone marrow-derived cell populations. In addition, we assessed the phenotype and transcriptomes of in vitro-generated canine monocyte-derived tumour-conditioned macrophages (TCMΦ) and compared them to classically (M1) and alternatively activated (M2) macrophages.

We prospectively enrolled dogs with treatment naïve OS (n=15), which we necropsied and sampled immediately after euthanasia. We divided these dogs into those with macroscopic metastases (n=5) and not (n=10). Control dogs without cancer (n=10), systemic inflammatory diseases, allergy, or atopy, and not receiving immunomodulating drugs were enrolled retrospectively from the pathology archives. Blood from healthy dogs (n=6) was collected to generate macrophages in vitro.

We performed chromogenic immunohistochemistry (IHC) with TP-3 to immunolabel micrometastasis in seven frozen lung samples from each dog with OS without metastases. We labelled samples from two dogs with OS with macroscopic metastases and two without cancer as controls. In vitro generated TCMΦ were compared to M1 and M2 macrophages using flow cytometry (CD206, CD209, CD11d, FcεRI, and LYVE-1) and RNA-sequencing. A lung sample from each of the 15 dogs with OS and ten control dogs without cancer was immunolabelled using multiplex immunofluorescence (CD204, CD206 and CD11d) to identify macrophages, their phenotype, and bone marrow-derived cells.

The main findings were:

- Pulmonary micrometastases could be detected with TP-3 immunohistochemistry in a subset of dogs with OS before macroscopic metastases had developed. The prevalence of micrometastases (20%) was significantly lower than expected based on post-surgical metastatic rates.

- TCMΦ had a high expression of several M2-associated phenotypical markers on flow cytometry, while RNA-Seq showed upregulation of several additional M2-markers. TCMΦ had an M2-skewed cytokine and chemokine profile and exhibited several similarities to human and murine TCMΦ.

- The number of CD204+ macrophages, CD206+ macrophages and monocytes, and CD11d+ bone marrow-derived cells (BMDCs) in the lungs of dogs with OS without metastases was significantly higher than in dogs without cancer. Similarly, the total nucleated cell count was higher in dogs with OS than in those without cancer. Dogs with established pulmonary metastases had significantly lower numbers of CD11d+ BMDCs than dogs with OS without metastases.

In summary, this thesis provides new insight into the early phases of metastasis in dogs with OS. Furthermore, the results help bridge the knowledge gap between canine and human tumour immunology and provides new markers to study tumour-associated macrophages (TAMs) in dogs. In addition, our findings support the existence of an immunological PMN in a naturally occurring cancer model.

Kreft er i dag ansett som vanligste dødsårsaken hos både mennesker og hunder, som oftest som følge av spredning av kreftsykdommen (metastatisk sykdom). Den premetastatiske nisjen (PMN) defineres som de metastasefremmende endringene som skjer i mikromiljøet i et organ der det kommer til å utvikles spredninger. Primærsvulsten danner den PMN i slike målorganer ved hjelp av løselige stoffer og ekstracellulære vesikler som føres med blodet. PMN-dannelse anses som et viktig steg i utviklingen av spredninger og er med på å bestemme hvor svulsten sprer seg. Osteosarkom (OS) er den vanligste primærsvulsten som oppstår i knoklene hos både mennesker og hunder, og har en stor evne til å metastasere på tross av en lav metastaseforekomst ved diagnosetidspunktet. Selv om de fleste hunder med OS utvikler lungemetastaser (>90%), er forekomsten av mikrometastaser og PMN dannelse ved diagnosetidspunktet ukjente.

I denne avhandlingen har vi undersøkt forekomsten av mikrometastaser og PMN dannelse, med fokus på makrofager og celler fra beinmargen, hos hunder med OS uten synlige metastaser. I tillegg har vi undersøkt fenotypiske egenskaper og genuttrykket til in vitro-produserte tumorkondisjonerte makrofager (TCMΦ). Disse makrofagene ble sammenliknet med klassisk aktiverte (M1) og alternativt aktiverte (M2) makrofager.

Vi rekrutterte hunder med OS som ikke hadde fått noen form for kreftbehandling (n=15) prospektivt og obduserte og samlet prøver fra disse umiddelbart etter avliving. Disse hundene ble så delt inn i to grupper; de med synlige metastaser (n=5) og de uten (n=10). Vi rekrutterte også kontrollhunder (n=10) retrospektivt fra patologiarkivene. Disse kontrollhundene var frie for systemiske inflammatoriske sykdommer og allergier, og hadde ikke stått på medisiner som kunne påvirke immunforsvaret. Vi samlet også blod fra friske hunder (n=6) for å produsere makrofager in vitro.

Vi gjennomførte immunhistokjemisk (IHC) farging, med TP-3, av syv nedfryste lungeprøver fra hver av hundene med OS uten metastaser for å identifisere mikrometastaser. I tillegg farget vi prøver fra to hunder med OS med metastaser og to hunder uten kreft som kontroller. In vitro-produserte TCMΦ ble sammenliknet med M1 og M2 makrofager ved hjelp av flowcytometri (med følgende markører: CD206, CD209, CD11d, FcεRI og LYVE-1) og RNA sekvensering. Én lungevevsprøve fra hver av de 15 hundene med OS og fra de 10 kontrollhundene uten kreft ble farget ved hjelp av immunfluoresens med følgende markører: CD204, CD206 og CD11d, for å kartlegge forekomsten av makrofager og deres fenotype, samt forekomsten av celler fra beinmargen (beinmargsderiverte celler, BMDCs).

Hovedfunnene våre var:

-Vi påviste mikrometastaser i lungene hos kun en liten andel av hundene med OS før de hadde utviklet synlige lungemetastaser ved hjelp av TP-3 immunhistokjemi. Forekomsten av lungemikrometastaser (20%) var betydelig lavere enn forventet basert på forekomsten av lungemetastaser etter fullstendig kirurgisk fjerning av primærsvulsten.

-TCMΦ hadde et høyt uttrykk av flere M2-typiske fenotypiske overflatemarkører ved flowcytometri. RNA-sekvensering viste i tillegg at ytterligere M2-typiske markører var oppregulerte i TCMΦ. Cytokin- og kjemokinprofilene til TCMΦ liknet på dem hos M2 makrofager og også på dem hos TCMΦ fra mennesker og mus.

-Forekomsten av CD204+ makrofager, CD206+ makrofager og monocytter, og CD11d+ BMDCs var høyere i lungene til hundene med OS uten metastaser enn hos hundene uten kreft. I tillegg var det totale antallet kjerneholdige celler høyere hos hunder med OS enn hos dem uten kreft. Hundene med etablerte lungemetastaser hadde betydelig lavere antall CD11d+ BMDCs i lungene enn hundene med OS uten synlige metastaser.

Resultatene i denne avhandlingen bidrar med ny kunnskap om de tidlige fasene av den metastatiske utviklingen hos hunder med OS. De bidrar også til å belyse kunnskapshull i tumorimmunologien hos hund, og vi har funnet nye markører som kan brukes til å studere TAMs hos hund. Funnene våre gir gode holdepunkter for å si at en immunologisk PMN faktisk forekommer hos en modell med naturlig oppstått kreftsykdom.