Intestinal functions and health of Ballan wrasse (Labrus bergylta) and lumpfish (Cyclopterus lumpus) : effects of variation in diet composition

Abstract

To rear cleaner fish together with Atlantic salmon (Salmo salar) is a biological strategy to keep sea lice away from the salmon. Ballan (B) wrasse (Labrus bergylta) and lumpfish (Cyclopterus lumpus) are the two species being farmed in Norway for this purpose. To support a rapid rise of cultivation scale, present knowledge needs strengthening, and in this context, in particular regarding their nutritional biology. Among the many aspects of biology, investigation of digestive physiology and nutrient requirement is necessary to be able to produce feed which supports good growth and high survival. Regarding B. wrasse, a stomach-less fish with short intestine, research conducted until the time of initiation of this PhD work had addressed some aspects of nutrient requirements, the suitability of some plant ingredients as nutrient sources, and the importance of feed consistency. Although some efforts had been made to describe the digestive system of the B. wrasse, essential information was still missing. For lumpfish, a fish with stomach and many pyloric caeca, hardly any knowledge on digestive physiology, nor on nutrient requirement was available. Therefore, the strategy and goal of this PhD work was to strengthen knowledge and understanding on digestive physiology and diet effects on intestinal functions and health in B. wrasse and lumpfish to secure good growth and health. To achieve this, the following strategies and goals were chosen for the present studies of B. wrasse (point 1 and 2) and lumpfish (point 1 and 3): 1. To characterize aspects of intestinal morphology and functions and effects of variation in diet composition for optimization of diet composition in accordance with the biology of the fish. 2. To describe effects of saponins which may occur in plant ingredients and may induce inflammation in the intestine and possible preventive effects of prebiotics. 3. To investigate effects of diet composition on disease resistance. The work in Paper I was carried out to profile key characteristics of intestinal functions and health in wild-caught Ballan wrasse to provide a reference for evaluation of diet effects on intestinal function and health in cultivated fish. To describe functional variation along the intestine, samples were collected from four, consecutive intestinal segments, i.e. IN1, IN2, IN3 and IN4 from the most proximal segment to the most distal segment, respectively. The intestinal structure appeared quite similar in the four different segments. The highest capacity for digestion and absorption was found in IN1. Regarding observed indicators of immune functions, IN4 stood out showing higher gene expression levels of immunoglobulin M (igm), suggesting a more important role of IN4 in the immune responses related to igm. Parasite infection, especially myxozoan parasites like Enteromyxum leei, coincided with infiltration of lymphocytic and eosinophilic granular cells in the submucosa and lamina propria. The aim of Paper II, which comprised a 5-week feeding trial with Ballan wrasse, was to gain better understanding of intestinal functions and health in cultivated Ballan wrasse and to generate knowledge of immune responses in the intestine induced by dietary components. During the trial, the fish were fed either a reference diet, the reference diet supplemented with i) soya saponins (0.7%) ii) a commercial prebiotic (Aquate™ SG, 0.4%) or iii) a combination of soya saponins and the prebiotics. Blood, intestinal tissue, and gut content from IN1 to IN4 were collected. No significant differences in fish growth were observed between the four dietary groups. Saponin supplementation, both alone and in combination with prebiotics, increased weight index of IN2 and IN3 and decreased blood plasma glucose, cholesterol, and total protein. Dry matter of intestinal content and activity of digestive enzymes were not affected by diet. Histomorphological analyses revealed a progressing inflammation with increased infiltration of immune cells particularly into the distal parts of the intestine in fish fed diets with saponins, both alone and in combination with prebiotics. Gene expression profiles obtained by RNA sequencing and quantitative PCR mirrored the histological and biochemical changes induced by the saponin load. The study demonstrated that Ballan wrasse gut health and digestive function may be markedly affected by feed ingredients containing antinutrients. Paper III presents results from two experiments conducted to deepen the knowledge of lumpfish intestine physiology. Experiment 1 was a 42-day feeding trial in which lumpfish were fed twelve different diets in the following ranges of macronutrients: Protein 43-68%, lipid 4-17%, and carbohydrate 6-17%. Intestinal tissue, gut content and liver were sampled from 6 fish per tank. The results showed that with increasing lipid level and corresponding decrease in protein level, there was a linear decrease in several of the observed biomarkers, including activity of brush border membrane digestive enzymes, expression of genes related to nutrient digestion and transport, ion exchange and immune regulation. Increased intracellular hyper-vacuolization (probably accumulation of lipid) was observed in gut and liver with increasing dietary lipid level. Fewer effects were observed for increased dietary carbohydrate and corresponding decreased protein level. Experiment 2 was a two-week feeding trial for estimation of macronutrient digestibility in which lumpfish were fed three diets, all containing 55% crude protein, with lipid to carbohydrate ratio of the low lipid diet of 7.5%/18.3%, the medium lipid diet of 3.8%/14.6%, and high lipid diet of 18.1%/9.5%. Fecal samples were collected as pooled samples per tank. These results showed that fatty acid digestibility increased as dietary lipid level increased. Of note, starch digestibility decreased greatly as starch level increased, whereas protein digestibility did not change as lipid or starch level varied. The work in Paper IV was conducted to follow up the study in Paper III, addressing disease resistance as indicated by the results of a challenge trial with Aeromonas salmonicida after a feeding period with diets varying in lipid/carbohydrates composition. Three experimental diets were formulated to have similar content of crude protein and ash but varying in content of lipid/carbohydrates from 6.7 / 18 – 18 / 8.1 %. Lumpfish with average start weight of 1.7 g were fed the experimental diets in triplicate tanks each for a period of 90 days. After termination of the feeding trial and subsequent collection of biological samples, remaining fish were challenged with atypical A. salmonicida. No significant effects of diet were observed for growth performance. Carcass composition showed increasing content of dry matter, lipid, protein, and energy with increasing dietary lipid level. Increasing dietary lipid also increased hepatic dry matter, lipid, and energy levels, while crude protein decreased. Blood plasma nutrient levels and liver function markers showed few significant effects of diet, but dietary lipid level increased plasma cholesterol. Intestinal trypsin activity increased with increasing dietary lipid, whereas activity of other digestive enzymes and digesta bile salt levels were unaffected by diet. Increasing lipid level also increased lipid accumulation in the enterocytes of the proximal and mid intestine. Expression profiling of genes related to digestive and immune function showed few effects of diet. The nutrient transporters fabp2 and slc15a1, as well as the immune genes mhcII, igm, and nfkb showed increases with dietary lipid levels, whereas the cholesterol transporter npc1l1 was suppressed. Diet composition did not affect the lumpfish’ resistance against A. salmonicida. To conclude, the variation in macronutrient composition induced modulations in metabolic, digestive and some immune functions. Modulations seemed however to be within normal ranges and did not produce clear impairments of immune responses to bacterial infection. Overall, the work of current thesis has increased the knowledge necessary for formulation of optimal diets for cleaner fish production in Norway, comprising, regarding the B. wrasse, general features of the intestine’s structure and function as well as inflammatory responses induced by antinutrients in the diet, and regarding lumpfish, knowledge strengthened for key aspect of intestinal structure and functions and effects of diet composition.

Bruk av rensefisk i oppdrett av Atlantisk laks (Salmo salar) er en biologisk strategi for å bekjempe lakselus. Berggylt (Labrus bergylta) og rognkjeks (Cyclopterus lumpus) er de to artene av rensefisk som det drives aktivt oppdrett på i Norge. Ny kunnskap, særlig innen ernæring, er nødvendig for å øke mulighetene for rensefiskeoppdrett. Blant mange aspekter av rensefiskbiologien, er studier av rensefiskens fordøyelsesfysiologi og ernæringsbehov nødvending, for å kunne tilby rensefisken et fôr som sikrer god vekst og overlevelse i en oppdrettssituasjon. Da dette PhD-arbeidet ble påbegynt fantes det, for berggylt, en mageløs fisk med kort tarm, noe kunnskap om ernæringsbehov, bruk av plantebaserte fôringredienser og viktigheten av pelletkonsistens. Imidlertid manglet mye essensiell kunnskap om berggyltens fordøyelsessystem. For rognkjeks, en fisk med mage og mange blindsekker, fantes det lite eller ingen kunnskap om fordøyelsesfysiologi eller ernæringsbehov. Hovedmålet med dette PhD-arbeidet var derfor å styrke kunnskapsgrunnlaget og forståelsen av hvordan fordøyelsesfysiologi og fôrsammensetning kan påvirke tarmfunksjon og tarmhelse hos berggylt og rognkjeks, for å sikre god vekst og helse. For å oppgå dette målet ble følgende delmål og strategier etablert for studier av berggylt (punkt 1 og 2) og rognkjeks (punkt 1 og 3): 1. Beskrive hvordan variasjoner i fôrsammensetning kan påvirke tarmens struktur og funksjon, for å kunne optimalisere fôrsammensetningen i henhold til fiskens biologi. 2. Beskrive effekter av saponiner, som forekommer i mange plantebaserte fôr og kan forårsake tarmbetennelse, og prebiotika, som kan fungere betennelsesdempende i fisketarmen. 3. Beskrive effekter av endring i fôrsammensetning på mottakelighet for sykdom. Arbeidet i Artikkel I ble gjennomført for å beskrive de viktigste forhold rundt tarmfunksjon og tarmhelse i villfanget berggylt, og dermed etablere et referansegrunnlag for studier av hvordan variasjoner i fôrsammensetning kan påvirke tarmfunksjon og tarmhelse i oppdrettet berggylt. For å beskrive variasjoner i tarmfunksjon langs tarmkanalen, ble prøver tatt fra fire påfølgende tarmsegmenter fra proksimal til distal del, i.e. IN1, IN2, IN3 og IN4. Tarmstrukturen var relativt lik i de fire segmentene. IN1 viste størst kapasitet for fordøyelse og opptak av næringsstoffer. Blant observasjoner relatert til immunfunksjon, hadde IN4 høyere genuttrykk av immunoglobulin M (igm), noe som kan tyde på at IN4-segmentet har en viktig rolle i igm-relatert immunfunksjon hos berggylt. Tarminfeksjoner forårsaket av myxozoaparasitten Enteromyxum leei ble observert i sammenheng med økt infiltrasjon av lymfocytter og eosinofile granulocytter i submucosa og lamina propria. Formålet med studien i Artikkel II, som innebar et 5-ukers fôringsforsøk med berggylt, var å øke den generelle forståelsen av tarmfunksjon og tarmhelse hos berggylt i oppdrett, samt å bidra med ny kunnskap om immunresponser i bergylttarm forårsaket av komponenter i fôret. I fôringsforsøket ble fisken tilbudt et referansefôr, samt referansefôret tilsatt i) soyasaponin (0,7%), ii) et kommersielt prebiotium (Aquate™ SG, 0.4%) eller iii) en kombinasjon av soyasaponin og prebiotikumet. Blod, tarmvev og tarminnhold fra IN1 til IN4 ble samlet inn. Ingen signifikante forskjeller i vekst ble observert mellom de fire fôrgruppene. Tilsetning av saponin, både alene og i kombinasjon med prebiotika, økte den relative vekten av tarmavsnittene IN2 og IN3, og førte til reduserte nivåer av glukose, kolesterol og totalprotein i blodplasma. Tørrstoffnivå i tarminnholdet og aktivitet av fordøyelsesenzymer ble ikke påvirket av diett. Histomorfologiske analyser påviste en fremtredende betennelsesreaksjon med økt infiltrasjon av immunceller i de bakre delene av tarmen hos fisk fôret med saponin, både alene og i kombinasjon med prebiotika. Genekspresjonsprofilering med RNA sekvensering og kvantitativ PCR viste effekter av saponinbehandlingen som samsvarte godt med de histomorfologiske og biokjemiske observasjonene. Studien demonstrerte dermed hvordan tarmhelse og fordøyelsesfunksjon hos berggylt kan påvirkes betydelig ved å benytte fôringredienser som inneholder antinæringsstoffer. Artikkel III presenterer resultater fra to separate studier som ble gjennomført for å styrke kunnskapen om tarmfysiologi hos rognkjeks. Eksperiment 1 var et 42-dagers fôringsforsøk der rognkjeks ble tilbudt tolv forskjellige fôr som varierte i innhold av makronæringsstoffer: Protein 43-68%, fett 4-17%, og karbohydrat 6-17%. Tarmvev, tarminnhold, og levervev ble tatt ut fra 6 fisk per kar. Resultatene viste, ved økende fettnivå og dermed redusert proteinnivå i fôret, en lineær nedgang i nivåer av en rekke biomarkører, inkludert aktivitet av børstesøms-fordøyelsesenzymer og genuttrykk relatert til fordøyelse og næringsstoffopptak, ioneregulering og immunfunksjon. Forøket intracellulær hypervakuolisering (trolig forårsaket av fettakkumulasjon) ble observert i både tarm og lever med økende fettnivå i fôret. Færre effekter ble observert ved å økte fôrets innhold av karbohydrater, og dermed redusere proteinnivået. Eksperiment 2 var et 2-ukers fôringsforsøk som ble gjennomført for å estimere fordøyelighet av makronæringsstoffer hos rognkjeks. Rognkjeks ble tilbudt tre forskjellige fôr som alle inneholdt 55% protein, men som hadde fett til karbohydrat forhold på henholdsvis 7,5%/18,3%, 18,8%/14,6% og 18,1%/9,5% for lavt, medium og høyfett fôr. Faecesprøver ble tatt som samleprøver fra hvert kar. Resultatene viste at fettsyrefordøyeligheten økte med økt tilsetning av fett i fôret. Et hovedfunn fra studien var at stivelsesfordøyeligheten ble kraftig redusert med økende mengde stivelse i fôret. Proteinfordøyeligheten ble ikke påvirket av endringer i fôrets fett- eller karbohydratinnhold. Arbeidet i Artikkel IV ble gjennomført som en oppfølging av resultatene fra studiene i Artikkel III. Hovedformålet var å studere sykdomsmottagelighet, basert på en smittestudie med Aeromonas salmonicida, etter å ha fôret rognkjeks med ulike dietter som varierte i innhold av fett og karbohydrater. Tre eksperimentelle fôr ble formulert til ha like nivåer av råprotein og aske, men med varierende fett/karbohydrat-ratio fra 6,7 / 18 til 18 / 8,1 %. Rognkjeks med gjennomsnittlig startvekt på 1,7 gram ble fôret på de eksperimentelle diettene i triplikate kar per fôr i 90 dager. Etter avslutning av fôringsforsøket og prøveuttak, ble resten av fisken smittet ble atypisk A. salmonicida. Ingen signifikante effekter av fôr ble observert for vekst. Kroppssammensetning viste økte nivåer av tørrstoff, fett, protein, og energi, ved økende fettinnhold i fôret. Økt fettnivå i fôr ga også økt tørrstoffinnhold, fett, og energinivå i lever, mens nivå av råprotein i lever ble redusert. Næringsstoffnivåer og markører for leverfunksjon i blodplasma viste få effekter av fôr, men økt fettnivå i fôr gav økte kolesterolverdier i blodplasma. Trypsinaktivitet i tarm økte med økende fettnivå i fôret, mens aktivitet av andre fordøyelsesenzymer, og gallesaltnivåer i tarminnhold ikke ble påvirket av endringer i fôrsammensetning. Økt fettnivå i fôret gav også økt grad av fettakkumulasjon i enterocyttene i proksimaltarm og midttarm. Ekspresjonsprofilering av gener relatert til fordøyelse og immunfunksjon viste få effekter av diett. Næringsstofftransportørene fabp2 og slc15a1, samt immungenene mhcII, igm, og nfkb viste økt uttrykksnivå med økende mengde fett i fôret, mens genuttrykket av kolesteroltransportøren npc1l1 ble redusert. Forsammensetning påvirket ikke dødelighet etter smitte med A. salmonicida. Det konkluderes med at variasjoner i fôrets sammensetning av makronæringsstoffer forårsaket endringer i metabolske, fordøyelsesrealterte, og immunrelaterte funksjoner i berggylttarmen. Endringene ble imidlertid vurdert til å være innenfor normal variasjon, og viste ingen klare effekter på immunrespons etter bakteriell smitte. Overordnet har arbeidet sammenfattet i denne PhD-avhandlingen bidratt med ny kunnskap som vil være nødvending for å kunne formulere optimalt fôr til bruk i rensefiskindustrien i Norge. For berggylt har arbeidet bidratt med ny generell kunnskap om tarmstruktur og tarmfunksjon, samt beskrevet betennelsesreaksjoner i tarm forårsaket av antinæringsstoffer i fôr. For rognkjeks har arbeidet bidratt med ny kunnskap om tarmstruktur, tarmfunksjon og effekter av endringer i fôrsammensetning.