Characterization of radioactive particle exposure using micro and nano-focused X-ray techniques

Abstract

Radionuclides may be introduced into the environment from a variety of sources both naturally occurring, such as weathering from ore deposits, and anthropogenic, such as releases associated with the nuclear weapons and fuel cycle. The environmental transport, ecosystem transfer, external and internal exposure, and biological effects of released radionuclides is dependent on the distribution of physico-chemical species (i.e., the speciation). In most events involving the release of refractory radionuclides to the environment, particles are expected to comprise an important fraction of the source term. The characteristics of these released aggregates of radioactive atoms are dependent on the source and release scenario. While relatively large particles can carry a substantial amount of radioactivity and act as point sources of radiological risk, submicron and nanometer sized particles may exhibit a greater environmental mobility and bioavailability. These colloids and nanoparticles are continuously generated by biogeochemical processes inducing weathering of larger particles as well as nucleation, particle growth, and aggregation mechanisms.

The present PhD project aimed to reduce uncertainties in environmental impact and risk assessments of particle contaminated sites by characterizing the exposure to radioactive particles (nm to mm). To this end, physico-chemical properties of spent nuclear fuel particles (> 0.45 μm), released during reprocessing activities at the Dounreay facility (Thurso, Scotland), were investigated to link the source term and release scenario to the environmental behavior and potential exposure to man and the environment. Furthermore, engineered uranium nanoparticles (UNPs) were used to study the uptake and retention of colloidal species (3 kDa < x < 0.45 μm) in aquatic model organism Daphnia magna. This research was carried out using a range of laboratory and synchrotron, micro and nano-focused analytical X-ray techniques including X-ray fluorescence (XRF), X-ray absorption near edge structure (XANES) analysis, and X-ray absorption computed tomography (CT), to complement the exposure characterization of Dounreay particles and standardized toxicity assessments according to OECD guidelines.

Focusing on the importance of linking physico-chemical characteristics to particle source term and release scenario, the spatial distributions of matrix elements including uranium were assessed in two different types of Dounreay spent fuel particles, Materials Test Reactor (MTR) and Dounreay Fast Reactor (DFR) particles (Paper I). Using laboratory-based micro-X-ray fluorescence analysis (μ-XRF), MTR particles were shown to contain a heterogenous distribution of U and Al indicative of the UAl4 dispersion fuel in the MTR reactor. In contrast, U and Nb were spatially correlated in DFR particles with stochiometric considerations indicative of a U-Nb alloy that formed as a result of the high temperature release scenario. These characteristics are important with respect to biogeochemical processes in the environment that could lead to weathering of particles and remobilization of radionuclides. The particle characterization was somewhat different from the existing contact dose risk assessment model, which only assessed MTR type particles and assumed a homogeneous distribution of radionuclides. Therefore, a revised dose assessment was conducted for each MTR and DFR particle characterized in this work. The results were consistent with the previous assessment and thus validated the existing model put forward by the Scottish Environmental Protection Agency (SEPA).

The potential uptake and retention of UNPs was studied in experiments by exposing freshwater invertebrate D. magna to well characterized UNP suspensions in moderately hard reconstituted water (MHRW, pH 6.8) (Paper II – III). Size fractionation results revealed U present in the LMM (< 3kDa, 0 – 53 %), the colloidal (3 kDa < x < 0.45 μm, 27 – 71 %), and the particulate fractions (> 0.45 μm, 5 – 44 %) suggesting both dissolution of the UNPs and aggregation. For comparison, D. magna were also exposed to similar concentrations of a U reference solution (URef) which featured a similar size distribution indicating colloidal species were formed. Acute toxicity tests showed that 48 h UNP exposures caused mortality in adult D. magna (LC50 = 402 μ L-1 [336 - 484]) but were slightly less toxic compared to the URef solution (LC50 = 268 μg L-1 [229 - 315]). Measurement of U body burden identified a 3- to 5-fold greater concentration in daphnia exposed to the UNPs (~ 20 – 60 ng daphnid-1). Furthermore, assessment of survival as a function of body burden indicated that uptake in UNP exposures, compared to the URef, was mainly comprised of species of lower specific toxicity despite the similar size distributions. Based on this assessment, daphnia specimens exposed at 320 ± 30.6 μg L-1 UNP and 159 ± 13.7 μg L-1 URef were prepared for a range of X-ray imaging analyses to assess U localization and histological effects.

The elemental biodistribution of the whole body (5 μm resolution) was determined by using synchrotron μ-XRF (μ-SRXRF) of intact, chemically dried D. magna samples (Paper II). Areas of significant U accumulation revealed heterogeneous U distributions throughout the daphnia and regions of interest (ROI) were chosen for 2 μm resolution scanning. Based on the high-resolution mapping, several organs were identified as targets of U exposure in both the UNP and the URef treatments including the gills (epipodites), the digestive tract, the heart, the maxillary gland, and the embryos. Biodistribution results identified potential uptake pathways via the epipodites and the intestine. Furthermore, U was highly accumulated in the nephridium, part of the maxillary gland that may represent a previously undescribed U detoxification route. Maternal transfer was confirmed by U present in the embryos of the UNP exposed organism. High U intensity in remains of egg chorion was also observed in the brood chamber. However, daphnia derived from sublethal (< LC50) exposures (UNP and URef) were able to reproduce despite maternal transfer. The F1 generation did exhibit, however, altered reproductive behavior, including earlier reproduction and increased fecundity compared to controls. Both μ-SRXRF and CT indicated the UNPs had aggregated in the digestive tract where they represented high local concentrations of U. However, given the toxicity test results, these aggregates appeared to be less bioaccessible than other species. Nano-focused synchrotron XRF analysis (nano-SRXRF, 75 nm step size) of histological sections of D. magna midgut from the URef exposure revealed U bound to ingested algae cells. This shows that the presence of residual feed even after evacuation of the intestine prior to exposure can influence the retention of U (Paper III).

Nano-SRXRF and μ-SRXRF with histological and anatomical analyses, were used to assess whether biological effects at the organ and tissue levels were co-localized with U. The results showed that the hepatic ceca, an organ associated with the production of digestive fluids, was a major target of exposure in both treatments (Paper III). Computed tomographic renderings revealed shrunken, straightened ceca following the 48 h exposure that was correlated with U entering the region via the midgut as shown by μ-SRXRF scans. Histological sections revealed that significantly damaged and destroyed epithelial cells were the underlying driver of morphological changes to the hepatic ceca. High resolution nano-SRXRF scans of the tissue sections showed U particulates (< 500 nm) throughout the damaged tissues and cells indicating a relationship between relatively high local U exposure and histological changes. The midgut was also severely affected following both exposures (UNP and URef) with evident tissues stress and deformities, although U could only be detected in a detached cell, and not in the epithelium, possibly due to concentrations below the limit of detection for the method.

In the presented work, analytical X-ray techniques were employed to characterize facets of the exposure to radionuclide bearing particles and nanoparticles. The characterization of Dounreay fuel particles provides novel inputs on physico-chemical properties critical for ecosystem transport and radiological dosimetry models, thus improving predictive environmental impact and risk assessments. The studies in this project also present the first detailed assessments of UNP uptake and retention, which revealed aggregation within the midgut and migration into the hepatic ceca of D. magna. By identifying target organs, including the epipodites and the maxillary gland, the results of this work have provided important contributions to our overall understanding of U toxicokinetics in cladocerans. Furthermore, combining micro and nano-focused XRF analysis with histological and anatomical analyses linked U distribution with adverse effects in organs, tissues, and cells to improve interpretation of toxicological consequences to the organism. Finally, the techniques demonstrated here provide an advanced platform to characterize the exposure of other types of toxicants to a variety of test organisms and should prove useful for future development of an aggregate exposure pathway framework (AEP).

Radionuklider slippes ut i miljøet fra en rekke naturlige og antropogene kilder som for eksempel vitring av malmmineraler og utslipp forbundet med kjernebrensel- og kjernevåpensyklusene. Transport i miljøet, overføring i økosystem, ekstern og intern eksponering, samt biologiske effekter av radionuklidene i miljøet vil avhenge av fordelingen av fysisk-kjemiske tilstandsformer (det vil si spesieringen). I de fleste hendelser som innebærer utslipp av ikke-flyktige radionuklider til miljøet vil det forventes at partikler utgjør en viktig andel av kildetermen. Egenskapene til disse aggregatene av radioaktive atomer som slippes ut er avhengige av utslippskilde og utslippsforløp. Mens relativt store partikler kan inneholde en vesentlig mengde radioaktivitet og fungere som punktkilder med tilhørende risiko, vil nanometermikrometer store partikler med potensielt større mobilitet og biotilgjengelighet kontinuerlig dannes gjennom biogeokjemiske prosesser som vitring av større partikler, partikkelvekst og aggregeringsmekanismer.

Målsetningen for dette PhD-prosjektet har vært å redusere usikkerhetene i miljø- og konsekvensutredninger for partikkelkontaminerte områder ved å karakterisere eksponeringen som knyttes til nanometer til millimeter store radioaktive partikler. Til dette formålet har brukt brensel partikler (> 0.45 μm) som ble sluppet ut i miljøet i forbindelse med reprosesseringsaktiviteter ved Dounreay-anlegget (Thurso, Scotland) blitt karakterisert med hensyn til partikkelegenskaper for å knytte kildeterm og utslippsforløp til potensielle effekter ved eksponering av mennesker og miljø. Videre har fremstilte uran nanopartikler (UNP, < 0.45 μm) blitt brukt i eksponeringsforsøk for å studere opptak og retensjon av uran i den akvatiske modellorganismen Daphnia magna. En rekke laboratorie- og synkrotronbaserte mikro- og nanofokuserte analytiske røntgenteknikker (XRF, XANES og CT) ble brukt for å komplementere eksponeringskarakteriseringen av Dounreay-partikler og standardiserte OECD toksisitetstester.

Med tanke på å knytte fysisk-kjemiske egenskaper til utslippskilde og utslippsforløp, ble romlig fordeling av matrikselementer inkludert uran undersøkt i to forskjellige typer Dounreay brukt brensel partikler, Materials Test Reactor (MTR) og Dounreay Fast Reactor (DFR) (Artikkel I). Ved bruk av laboratoriebasert μ-XRF, ble det vist at MTR partiklene er karakterisert ved en heterogen fordeling av U og Al som reflekterer UAl4 brenselet i MTR-reaktoren. I DFR partiklene var derimot den romlige fordelingen av U og Nb korrelert og støkiometriske betraktninger tydet på at en U-Nb legering ble dannet som resultat av de høye temperaturene under utslippsforløpet. Disse egenskapene er viktige for å vurdere vitring av partikler og remobilisering av radionuklider som følge av biogeokjemiske prosesser i miljøet. Partikkelegenskapene var ikke helt i samsvar med de som ble brukt i tidligere risikovurderinger av doser forbundet med kontakt med partikler, som var basert på kun MTR partikkelkarakteristika og antok homogen fordelinger av radionuklider. I dette arbeidet ble det derfor utført en revidert risikovurdering av kontaktdosimetri for både MTR og DFR partiklene som var tilgjengelig i dette arbeidet. Resultatene viste at den eksisterende dosemodellen som brukes av Scottish Environmental Protection Agency (SEPA) gir gode resultater for begge typer partikler.

Potensielt opptak og retensjon av UNP i ferskvanns- og invertebratorganismen Daphnia magna ble undersøkt ved eksponering til karakteriserte suspensjoner av nanopartiklene i ‘moderately hard reconstituted water’ (MHRW, pH 6.8) (Artikkel II – III). Størrelsefraksjonering viste U fordelt i lavmolekylære former (< 3kDa, 0 – 53 %), kolloider (3 kDa < x < 0.45 μm, 27 – 71 %) og partikler (> 0.45 μm, 5 – 44 %), hvilket tyder på oppløsning av U fra UNP samt aggregeringsprosesser i suspensjonene. D. magna ble også eksponert for sammenliknbare konsentrasjoner av en U referanseløsning (URef) med tilsvarende størrelsesfordelinger inkludert dannelser av kolloider. Akutt toksisitetstester viste at 48 timers UNP eksponeringer forårsaket noe lavere dødelighet i voksne D. magna (LC50 = 402 μg L-1 [336 - 484]) enn URef løsningene (LC50 = 268 μg L-1 [229 - 315]). Total opptak av uran målt ved ICP-MS analyse viste 3-5 ganger høyere nivå pr daphnia fra UNP (~ 20 – 60 ng daphnid-1) som for URef (~ 10 – 20 ng daphnid-1) eksponeringer. Analyse av overlevelse av total opptak av UNP var dominert av tilstandsformer med lavere spesifikk toksisitet sammenlignet med URef eksponeringen selv om fraksjoneringen viste lik størrelsesfordeling. Basert på resultatene fra toksisitetstestene, ble daphnia eksponert for 320 μg L-1 UNP og 159 μg L-1 URef preparert for en rekke analyser med ulike røntgenteknikker for å undersøke U biodistribusjon og histologiske effekter.

Helkropps elementfordelinger (5 μm romlig oppløsning) ble analysert ved hjelp av synkrotronbasert μ-XRF (μ-SRXRF) på intakte, kjemisk dehydrerte D. magna (Artikkel II). Heterogene fordelinger på ulike deler av daphnia viste seg som områder med særlig høy akkumulering av U. På grunnlag av disse fordelingene ble områder av særlig interesse (ROI) valgt ut for elementfordelingsanalyse ved høyere oppløsning (2 μm). Disse analysene identifiserte høy akkumulering av U i flere organer inkludert gjeller (epipoditter), fordøyelseskanalen, hjertet, nephridium og ‘maxillary gland’ (nyre) og embryoer, fra både UNP og URef eksponeringer. Biodistribusjonsresultatene identifiserte en sannsynlig opptaksvei for U via gjeller (epipodite) og fordøyelsessystemet. I tillegg sannsynliggjør de høye U verdiene i «nyre» (nephridium og maxillarykjertelen) at dette organet utgjør et hittil ubeskrevet ekskresjons-/detoksifiseringssystem. Deteksjon av U i embryo i yngelkammeret bekrefter overføring fra mor til avkom. Det ble også påvist høye U nivåer i rester av eggekapsel (chorion). Til tross for overføring av U fra mor til avkom var daphnia eksponert for subletale konsentrasjoner (< LC50) av UNP og URef i stand til å produsere levedyktige avkom. F1 generasjonen viste likevel endringer i reproduktiv adferd, inkludert tidligere reproduksjon og økt kullstørrelse. Resultater fra både μ-SRXRF og CT viste at UNP aggregerte og ble oppkonsentrert i fordøyelseskanalen slik at de representerte høye lokale konsentrasjoner av U, men basert på de høyere LC50 verdiene for UNP ser det ut til at aggregatene var mindre biotilgjengelige enn andre tilstandsformer av uran. Nano-XRF (75 nm oppløsning) elementfordelingsanalyse utført på histologiske snitt av tarmen på D. magna etter URef eksponering viste at U var bundet til delvis nedbrutte algeceller. Dette viser at det er rester av fôr i tarmen selv når daphnia ikke mates siste døgnet før eksponering, og at dette kan påvirke retensjon av uran (Paper III).

Ved å kombinere nano-SRXRF og μ-SRXRF med analyser av histologi og anatomiske endringer for å vurdere om biologiske effekter var samlokalisert med høy akkumulering av uran, ble det etter begge typer eksponering påvist at hepatic ceca, et organ som er knyttet til produksjon av fordøyelsesvæsker, er et viktig målorgan (Paper III). Etter 48 timers eksponering viste CT-analyser i kombinasjon med μ-SRXRF elementfordelinger at innskrumpne og forlengede hepatic ceca var korrelert med translokasjon av uran fra mellomtarmen til de skadede organene. Histologi av mikrotomsnitt viste at betydelig skadde og ødelagte epitelceller var en underliggende årsak til de morfologiske endringene i hepatic ceca. Ved hjelp av høyoppløste nano-SRXRF elementfordelingsanalyser av mikrotomsnitt ble det gjennomgående påvist U partikler (< 500 nm) i skadde celler som indikerer at det er en sammenheng mellom høy lokal uraneksponering og histologiske endringer. Epitelceller i mellomtarmen på daphnia ble også betydelig stressede og deformerte som følge av begge typer uran eksponering (UNP og URef), men i disse cellene ble uran ikke detektert, enten på grunn av begrensninger knyttet til prøveprepareringen eller metodens deteksjonsgrense.

I dette arbeidet har analytiske røntgenteknikker blitt benyttet til å karakterisere eksponering av nanometer-millimeter store radioaktive partikler. Karakteriseringen av Dounreay brenselspartikler har gitt ny informasjon om fysisk-kjemiske egenskaper med betydning for transport i miljøet og radiologiske dosimetrimodeller og som vil bidra til forbedrede miljø og risikokonsekvensvurderinger. Dette arbeidet omfatter også de første detaljerte undersøkelser av UNP opptak og retensjon i biota og viste at nanopartiklene aggregerer i tarmen til daphnia og translokeres til hepatic ceca. Gjennom å identifisere målorganer for uran, inkludert epipodittene og maxillarykjertelen, har dette arbeidet gitt viktige bidrag til forståelsen av urans toksikokinetikk hos akvatiske cladocera organismer. Videre har det å kombinere mikro- og nanofokuserte XRF elementfordelingsanalyser med analyser av histologiske og anatomiske endringer gjort det mulig å knytte akkumulering av uran med skadelige effekter på organ-, vev- og cellefunksjoner og på den måten forbedre grunnlaget for tolkningen av toksikologiske konsekvenser for organismen.

Metodene som er presentert i dette arbeidet representerer en avansert plattform som kan brukes til å karakterisere eksponering av en rekke testorganismer, også overfor en rekke andre kontaminanter inkludert partikulære og kolloidale former, slik at de kan integreres i fremtidige aggregerte eksponeringsforløp (AEP)-rammeverk.