Bovine staphylococci and their spectrum of antimicrobial resistance and virulence characteristics

Abstract

Staphylococci are a group of bacteria capable of colonizing and infecting a variety of host species and causing disease in a range of different tissues. Staphylococcus aureus is the most studied staphylococcal species and can cause both clinical and subclinical mastitis in bovines, as well as infections in a range of other species. This bacterium is associated with an array of virulence factors that contributes to its survival and spread. Non-aureus staphylococci (NAS) have, on the other hand, traditionally been regarded as a uniform group with an uncertain clinical importance, but in recent years they have emerged as the most frequently isolated bacterial group from bovine milk in many countries and they are increasingly associated with bovine udder infections. NAS are also regarded as a potential reservoir for antimicrobial resistance genes. Regarding the virulence of NAS, less is known about their content of virulence genes and their mechanisms for colonizing and infecting their hosts. In addition to their large host and tissue range, staphylococci can acquire resistance to a variety of antimicrobial agents, of which methicillin resistant strains are of particular public health concern, especially methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). The term methicillin resistance incorporates resistance to almost all β-lactam antimicrobials, including penicillins and most cephalosporins. This resistance is mediated by the penicillin-binding protein PBP2a, encoded by mec genes, such as mecA. To study the interaction between PBP2a and different β-lactam antimicrobials an IPTG-inducible mecA was introduced into a methicillin sensitive laboratory S. aureus strain. This confirmed that expression of PBP2a protects against β-lactam antimicrobials. By testing the resistance of the strain to a panel of nine different β-lactams, variations in the level of protection against different agents were shown. Microfluidics fluorescence time-lapse microscopy also demonstrated a considerable phenotypic variation between cells exposed to β-lactams. This also showed that mecA-expressing S. aureus can survive β-lactam concentrations considerably higher than the minimal inhibitory concentration. As well as studying mechanisms related to the important methicillin resistance in staphylococci, the antimicrobial resistance and virulence characteristics in a collection of bovine staphylococci were examined, using disc diffusion, PCR and whole genome sequencing. The results showed that there was more antimicrobial resistance in NAS, compared to S. aureus, but the MRSA isolates stood out with a higher proportion of resistance characteristics compared to methicillin sensitive S. aureus. Regarding virulence, S. aureus contained a higher number of virulence genes compared to NAS. There were, however, also differences in virulence gene content between different NAS species, with species such as Staphylococcus chromogenes having a higher content of virulence genes compared to most other NAS species. In summary, the findings in this thesis support the notion that there is great diversity within the genus Staphylococcus, not only between S. aureus and NAS, but also within the NAS and within a population of mecA expressing S. aureus. The results may have consequences for antimicrobial treatment of staphylococcal infections and show the need to tailor the choice of antimicrobial treatment regimen to the bacterial species in question and its antimicrobial resistance and virulence.

Stafylokokker er en gruppe bakterier som er i stand til å kolonisere og infisere både mennesker og mange forskjellige dyrearter, og bakteriene kan gi sykdom i flere ulike vev. Staphylococcus aureus er den mest studerte stafylokokkarten og kan forårsake både klinisk og subklinisk mastitt hos kyr. I tillegg kan S. aureus være årsak til ulike infeksjoner hos en rekke andre dyrearter. Dette skyldes ikke minst et stort utvalg av virulensfaktorer som bidrar til bakteriens overlevelse og spredning i verten. Non-aureus stafylokokker (NAS) har, i motsetning til S. aureus, tradisjonelt blitt ansett som en ensartet gruppe med usikker klinisk betydning. De senere år er imidlertid NAS rangert som de vanligste bakteriene isolert fra kumelk i flere land, og de blir stadig oftere satt i forbindelse med infeksjoner i juret hos melkekyr. NAS blir også ansett som et mulig reservoar for antimikrobielle resistensgener. Mindre er kjent om virulensen hos NAS, både når det gjelder innholdet av virulensgener og mekanismene for kolonisering og infeksjon av verten. I tillegg til deres store verts- og vevsspekter kan stafylokokker tilegne seg resistens mot mange forskjellige antimikrobielle midler, hvor meticillinresistente stammer er spesielt utfordrende, særlig meticillinresistente S. aureus (MRSA). Begrepet meticillinresistens innbefatter resistens mot nesten alle β- laktamantibiotika, inkludert penicilliner og de fleste cefalosporiner. Resistensen skyldes det penicillin-bindende proteinet PBP2a, som er kodet av mec gener, blant annet mecA. For å studere interaksjonen mellom PBP2a og forskjellige β-laktamantibiotika ble et IPTG indusertbart mecA gen satt inn i en meticillinsensitiv S. aureus laboratoriestamme. Dette bekreftet at ekspresjon av PBP2a beskytter mot β-laktamantibiotika. Ved å teste laboratoriestammens resistens mot ni forskjellige β-laktamer ble det konkludert med at graden av beskyttelse mot de forskjellige midlene varierte. «Microfluidics fluorescence time lapse»- mikroskopi viste en tydelig fenotypisk variasjon mellom celler som ble eksponert for β-laktamantibiotika. Dette viste også at S. aureus som uttrykker mecA kan overleve β-laktam konsentrasjoner som er betydelig høyere enn minste inhibitoriske konsentrasjon. I tillegg til å studere mekanismene knyttet til meticillinresistens i stafylokokker, ble antimikrobiell resistens og virulensegenskaper hos en samling bovine stafylokokker studert ved hjelp av disk diffusjon, PCR og helgenomsekvensering. Resultatene viste at NAS hadde en høyere andel antimikrobiell resistens sammenlignet med S. aureus, men MRSA isolatene skilte seg ut i S. aureus gruppen med en høyere andel resistens sammenlignet med meticillinsensitive S. aureus. Når det gjelder virulens hadde S. aureus en høyere andel virulensgener sammenlignet med NAS. Det var imidlertid også forskjeller i innholdet av virulensgener i forskjellige NAS arter. For eksempel hadde Staphylococcus chromogenes en høyere andel virulensgener sammenlignet med flere andre NAS arter. Funnene i denne avhandlingen støtter antakelsen om at det et stort mangfold innen genuset Staphylococcus, ikke bare mellom S. aureus og NAS, men også innad i NAS eller i en populasjon av S. aureus som uttrykker mecA. Resultatene kan ha betydning for antimikrobiell behandling av stafylokokkinfeksjoner og viser behovet for skreddersydde antimikrobielle behandlingsregimer som tar hensyn til den aktuelle bakteriearten og dens resistens og virulens.