Choline is an essential nutrient for post-smolt Atlantic salmon (Salmo salar L)

Abstract

The aquaculture feed industry continuously works to decrease the share of marine ingredients in the diets by searching for alternative feed ingredients. The increased use of such ingredients, on one hand expose the fish for new components, and on the other hand reduce the levels of components typical for diets rich in marine ingredients. Salmon diets have, over the last decades, also changed regarding lipid content. The level has increased, whereas the proportion of n-3 fatty acids has decreased. These changes may present challenges for the aquaculture industry. Fish farmers have, since 2000, reported symptoms of lipid malabsorption (LMS) in young as well as more mature salmon. The typically characteristics of LMS are swollen, pale and coarse appearance of the pyloric and mid intestine as a result of lipid accumulation in the tissue, seen histologically as large vacuoles. Previous studies have indicated that impaired lipoprotein formation, as a result of lack of phosphatidylcholine, could be the cause of the formation of excessive intestinal lipid vacuolation. Phosphatidylcholine is not considered as an essential nutrient for any fish species as it can be synthesized if sufficient choline is present. However, essentiality of choline has been established for many animal species, including some fish species in particularly for early stages, but not for any life stages of Atlantic salmon. In this thesis, three separate experiments were conducted to increase knowledge on the effects of choline and other key components involved in lipid and sterol metabolism on the development of LMS in Atlantic salmon in seawater. The experiments included firstly investigating whether choline chloride could prevent LMS. Secondly, whether other key components in lipid and sterol metabolism may modify the development of symptoms of LMS. The goal of the last experiment was to define the dietary requirement of choline for Atlantic salmon in seawater. The results from the first experiment showed that fish fed a diet with a choline level of 944 mg/kg developed clear signs of LMS whereas a diet supplemented to contain 4250 mg/kg choline, did not develop such signs. The level of triglycerides (TAG) in the pyloric caeca of fish fed the high choline diet was reduced by 65%. This reduction was reflected in a parallel reduction in relative weight of the pyloric intestine. Choline altered the intestinal expression of genes related to phosphatidylcholine synthesis (chk and pcyt1a), cholesterol transport (abcg5 and npc1l1), lipid metabolism and transport (mgat2a and fabp2), lipoprotein formation (apoAI and apoAIV) and the surface marker of intestinal lipid droplets (plin2). Furthermore, fish growth increased by 18% in the choline supplemented group. Taken together, these results demonstrated the importance of choline in lipid turnover in the intestine and its ability to prevent LMS. The results in the second experiment confirmed those of the first, showing that fish fed a diet low in fish meal (LF), with a choline level of 1190 mg/kg, developed clear LMSsymptoms, whereas fish fed diets with high fish meal content and a choline level of 1860 mg/kg, did not show clear signs of LMS. Supplementation of LF with phosphatidylcholine or choline chloride, resulting in choline levels of 2870 and 2980, respectively, eliminated the LMS symptoms. Supplementing the low fishmeal basal diet, containing 1190 mg/kg choline, with either taurocholate at two levels (3.5 and 6.9 g/kg), cholesterol (2.0 g/kg), taurine (0.8 g/kg), cysteine (0.8 g/kg) or methionine (1.0 g/kg) did not reduce the LMS symptoms. No significant dietary effects on growth rate were observed in this experiment. The results from the intestinal gene expression evaluation showed that phosphatidylcholine altered the expression of pcyt1a, a gene involved in phosphatidylcholine synthesis and the cholesterol transporter abcg5. Both choline and phosphatidylcholine altered the intestinal gene expression for apoAIV related to lipoprotein formation and markedly suppressed plin2, the surface marker of intestinal lipid droplets. Supplementation with methionine, did not alter expression of genes involved in endogenous synthesis of choline. Cholesterol supplementation suppressed the expression of genes involved in sterol uptake and de novo cholesterol synthesis and induced genes involved in sterol efflux from the intestinal mucosa. Taurocholate and taurine induced expression of genes involved in their respective metabolic pathways. These results confirmed the importance of choline observed in the first experiment, which was supplied either as choline chloride, phosphatidylcholine or as a constituent in fishmeal, in lipid turnover in the intestine as well as its ability to prevent LMS. The last experiment, a dose-response study testing nine levels of choline ranging from 1340 to 4020 mg/kg choline, demonstrated a clear inverse relationship between dietary choline level and the degree of vacuolation in the mucosa of the pyloric intestine of Atlantic salmon. Analyses of the lipid content in the tissue confirmed that this was mainly due to reduction in the level of TAG and diacylglycerol (DAG). Fish growth was not affected by dietary choline in this study. Other biomarkers, such as relative weight of the proximal intestine including the pyloric caeca and mid intestine, macroscopically observed whiteness and histologically observed vacuolation of the pyloric intestine, and expression of the genes pcyt1a, apoAIV, apoAI and plin2 (biomarkers with a close functional association to lipid transport) also showed a clear dose-response relationship with dietary choline level. This make them suitable as biomarkers for the estimation of the choline requirement. Based on the results for these biomarkers an average choline requirement, covering 50% of the population, of 2936 mg/kg was estimated. To cover the needs of 95% of the population, a level as high as 3350 mg/kg choline would be required. The results from all three experiments clearly showed that Atlantic salmon in seawater, fed a low fishmeal diet containing between 944-1340 mg/kg choline and 26-29% lipid, must be supplemented with a choline source in an amount which increases the level to 3350 mg/kg, to prevent developed LMS. Insufficient supply of choline impairs assembly of the intestinal lipoproteins engaged in lipid transport, resulting in impaired lipid transport capacity across the enterocytes and intracellular lipid accumulation. At higher feed intake and/or higher lipid levels in the diet than in the present studies, an even higher level may be required. The work presented in this thesis provides important knowledge on choline’s role in lipid transport in the intestine, and has, for the first time, established a basis for defining choline requirement in salmon kept in seawater. It will further help to improve the gut health of Atlantic salmon in Norway.

Fiskefôrindustrien jobber kontinuerlig for å redusere innholdet av marine ingredienser i fôrene ved å søke etter alternative ingredienser. Den økte bruken av alternative ingredienser utsetter imidlertid fisken for nye næringsstoffer, og reduserer nivåene av næringsstoffer som er typiske for de marine ingrediensene. I de siste tiårene har fôrene til oppdrettslaks endret seg betydelig, også når det gjelder innhold av lipid. Nivået av lipid har økt, mens andelen av n-3 fettsyrer på samme tid har gått ned. Disse endringene kan ha medført utfordringer for fisken. Oppdrettere har siden 2000 rapportert om symptomer på at opptaket av lipider hos oppdrettslaksen ikke er optimalt, og at det medfører såkalt lipidmalabsorpsjon (LMS). Dette gjelder fisk både i ferskvann og i sjø. Typiske symptomer på LMS er fortykket tarmvev og en hvitfarget og grov overflate i både fremre og midtre deler av tarmen, i motsetning til den normale, lyserosa fargen. Symptomene er et resultat av unormal akkumulering av lipid i vevet, som vises som store, intracellulære vakuoler i histologiske snitt. Tidligere studier indikerer at nedsatt dannelse av lipoproteiner på grunn av mangel på fosfatidylkolin, kan være årsaken til økningen av lipidvakuoler. Fosfatidylkolin er ikke regnet som et essensielt næringsstoff, ettersom fisken kan syntetiserer denne viktige komponenten når kolin er til stede. Kolin derimot, er definert som essensielt næringsstoff for mange dyr, oftest i tidlige livsstadier. For fisk er behovet for kolin definert for tidlige stadier for noen fiskearter, men ikke for noen livsstadier hos Atlantisk laks. Denne avhandlingen omfatter resultater fra tre forsøk, alle med mål om å øke kunnskapen angående effekter av kolin og andre nøkkelkomponenter involvert i lipid og sterol metabolismen på utviklingen av LMS hos atlantisk laks i sjøvann. I det første forsøket ble det undersøkt om kolinklorid kunne forhindre utvikling av LMS hos atlantisk laks i sjøvann. Det påfølgende forsøket fulgte opp resultatene fra første forsøk og undersøkte om andre nøkkelkomponenter i lipid og sterol metabolismen kan påvirker utviklingen av LMS symptomer. Målet med det siste forsøket var å definere kolinbehovet for laksens i sjø. Resultater fra det første forsøket viste at fisk som fikk et fôr som inneholdt 944 mg/kg kolin, utviklet tydelige tegn på LMS mens et fôr med et kolininnhold på 4250 mg/kg, ikke utviklet slike tegn. Den relative vekten av fremre del av tarm og innholdet av triglyserider (TAG) i blindsekkene var redusert med henholdsvis 40% og 65%, hos fisk som fikk fôret med høyt kolininnhold. Høy kolintilførsel endret uttrykket av gener som er involvert i syntesen av fosfatidylkolin (chk and pcyt1a), transport av kolesterol (abcg5 and npc1l1), metabolisme og transport av lipid (mgat2a and fabp2), dannelse av lipoproteiner (apoA1 and apoAIV) og dannelse av lipidvakuoler i tarmen (plin2). Tilsetning av kolin ga dessuten en økning i tilvekst på 18%. Tilsammen viser disse resultatene kolins viktige rolle i lipidomsetningen i tarmen og dermed for å forhindre LMS. Det andre forsøket bekreftet funnene fra det første forsøket og viste at fisk gitt et fôr med lavt fiskemel (LF) og med kolininnhold på 1190 mg/kg ga klare LMS-symptomer, mens fisk som ble gitt fôr med høyt fiskemelinnhold, med et kolininnhold på 1860 mg/kg, ikke hadde vesentlige tegn på LMS. Tilskudd av fosfatidylkolin eller kolinklorid til LF, som ga kolinnivåer i fôrene på hhv 2870 og 2980 mg/kg, eliminerte symptomene på LMS. I dette forsøket var det ingen signifikante effekter av kolinnivå i fôret på veksthastighet hos fisken. Tilskudd av andre komponenter som er viktige i omsetningen av lipider, dvs. to nivåer av taurokolat (3.5 and 6.9 g/kg), kolesterol (2.0 g/kg), taurin (0.8 g/kg), cystein (0.8 g/kg) eller metionin (1.0 g/kg) til LF, ga ingen reduksjon i LMS-symptomene. Evalueringen av effekter av tilskuddene på genuttrykk viste at fosfatidylkolin påvirket uttrykket av pcyt1a, som er involvert i syntesen av fosfatidylkolin, og kolesterol transportøren, abcg5. Et økt uttrykk av apoAIV, indikator for lipoproteindannelse, og en markert nedregulering av plin2, indikator for dannelse av lipidvakuoler, ble observert i både kolin- og fosfatidylkolin fôret fisk. Tilsetning av metionin, en viktig metyldonor som er nødvendig for kolinsyntese, ga ikke økninger i uttrykk av gener i synteseveiene for kolin. Økt innhold av kolesterol i fôret medførte i en reduksjon i uttrykket for gener involvert i opptak av steroler og de novo syntese av kolesterol, mens uttrykket av gener involvert i transporten av steroler gjennom slimhinnene i tarmen økte. Tilsetning av taurokolat og taurin induserte uttrykk av gener i deres respektive metabolske reaksjonsveier. Resultatene fra dette andre forsøket bekreftet den sentrale rollen kolin spiller i lipid omsetningen i tarmen og for å forhindre LMS. Det siste forsøket, som hadde som mål å estimere behovet for kolin hos post-smolt laks, var et dose-respons forsøk med ni nivåer av kolin fra 1340 til 4020 mg/kg. Resultatene viste et klart, omvendt forhold mellom kolinnivået i fôret og graden av lipidvakuolisering i tarmslimhinnene. Analyser av lipid innholdet i vevet fra den proksimale delen av tarmen viste at årsaken til reduksjonen i vakuolisering hovedsakelig var en reduksjon i innholdet av TAG og diacylglycerol (DAG). Veksten hos fisken var i dette forsøket ikke påvirket av kolininnholdet i fôret. Andre biomarkører, dvs relativ vekt av fremre del av tarm inkludert blindsekker og midttarm, makroskopisk synlig hvitfarget overflaten av fremre del av tarm og midttarm, vakuolisering av enterocyttene i blindsekkene, og ekspresjon av genene pcyt1a, apoAIV, apoAI and plin2 (biomarkører med en funksjonell tilknytning til lipidtransport) viste også et klart dose-responsforhold med kolinnivå i fôret. Dette gjør dem egnet som biomarkører for å estimere behovet for kolin. Basert på resultatene for disse biomarkørene ble det gjennomsnittlige behovet for kolin, det vil si nivået som dekker 50% av populasjonens behov, estimert til 2936 mg/kg. For å dekke behovet til 95 % av fiskene trengs 3350 mg/kg. Resultatene fra de tre forsøkene viser klart at fôr med lavt innhold av fiskemel, med kolininnhold mellom 944-1340 mg/kg, og som inneholder 26-29% lipid, må tilsettes en kolinkilde, i en mengde som gir et nivå på 3350 mg/kg fôr, for å forhindre utviklingen av LMS. Utilstrekkelig tilgang på kolin forhindrer dannelsen av lipoproteiner i enterocyttene, og derved transporten av lipid gjennom cellene til blodet, med intracellulær opphoping av lipid i store vakuoler som resultat. Ved høyere fôrinntak og/eller høyere lipid nivå i fôrene enn det som var tilfelle i disse forsøkene, er behovet kanskje enda høyere, noe som bør studeres i framtidige forsøk. Dette doktorgradsarbeidet har frembragt viktig informasjon om kolins rolle i lipidtransport i tarmen og har, for første gang, gitt grunnlag for å definere behov for kolin hos atlantisk laks i sjøvann. Resultatene vil bidra til forbedring av tarmhelsen hos norsk oppdrettslaks.