Kvantitativ analyse av kortisol og kortison ved LC-HRMS i Atlantisk laks (Salmo salar), og sammenlikning av analysedata mellom LC-HRMS og ELISA

Abstract

Oppdrett av Atlantisk laks (Salmo salar) har lenge vært en stor og viktig næring i norsk økonomi. Oppdrettsindustrien har i lengre tid opplevd problemer med ulike sykdommer som medført høy dødelighet. I den siste tiden har også fokuset på god fiskevelferd og bærekraft økt. I forskningsprosjektet BioDirect forskes det på ulike diagnostiske verktøy som raskt og presist kan påvise sykdom ut fra forskjellige biomarkører som utskilles av individet ved negative ytre påvirkninger. Det forskes også på etablering av bioassays som i fremtiden kan erstatte forsøk på dyr. Ved bruk av biomarkører er det mulig å innhente informasjon om sykdommer og fiskens helsetilstand fra ulike matrikser, eksempelvis blod, slim og avføring. Ut fra dette kan den molekylære sammensetningen i disse matriksene gi informasjon om dyrets helsetilstand. På denne måten kan sykdommer diagnostiseres raskt, samt klargjøre påvirkningen av det ytre miljøet. Denne oppgaven setter fokus på kvantitativ analyse av kortison og kortisol som biomarkører for stress hos Atlantisk laks. Kronisk stress kan påvirke laksen negativt ved suppresjon av laksens immunforsvar, og på denne måten øke mottakeligheten for sykdommer som kan føre til død. Det er viktig å praktisere god fiskevelferd av etiske og kvalitetsmessige grunner. Kortison og kortisol utskilles i laksen ved stress. Plasma og overflateslim kan være egnede matrikser for å påvise akutt stress, og fiskeskjell kan være en god matriks å påvise kronisk stress. Ut fra dette ble det utviklet en metode for kvantitative analyser av disse matriksene med hensyn på kortison og kortisol. Kortison og kortisol ble ekstrahert fra plasma, overflateslim og fiskeskjell ved væske-væske- ekstraksjon og fast stoff-væske-ekstraksjon med metyl tert-butyleter (MTBE). Analysen ble gjennomført ved mobilfasegradient på 35 % mobilfase B og 65 % mobilfase A. Mobilfasesammensetningen ble bestemt til ultrarent vann og MeOH (metanol) tilsatt maursyre (0,1 %, v/v). Kvantifiseringen ble gjennomført ut fra adduktionet [M+H]+. Det ble gjennomført forsøk med derivatisering for å prøve å øke sensitiviteten og dermed oppnå lavere deteksjonsgrense (LOD) for overflateslim. Det ble ikke oppnådd tilstrekkelig økning i signal, og av den grunn frafalt bruk av derivasjonsreagenser. Ut fra validering av kvantitative analyser av kortison og kortisol i plasma ble god linearitet oppnådd (R2 ≥ 0,97). LOD for kortison og kortisol ble bestemt til henholdsvis 2,1 ng/mL og 2,3 ng/mL. Kvantifiseringsgrensen (LOQ) for kortison og kortisol ble bestemt til henholdsvis 7,1 ng/mL og 7,7 ng/mL. Det ble ikke påvist matrikseffekter i plasma. Utvidet måleusikkerhet for metoden ble beregnet til 8,0 % for kortison og 9,0 % for kortisol. For kvantitative analyser av kortison og kortisol i overflateslim ble også god linearitet oppnådd (R2 ≥ 0,97). LOD for kortison og kortisol ble bestemt til henholdsvis 2,9 ng/mL og 1,8 ng/mL. LOQ for kortison og kortisol ble bestemt til henholdsvis 9,6 ng/mL og 6,0 ng/mL. Det ble ikke påvist matrikseffekter i overflateslim. Utvidet måleusikkerhet for metoden ble beregnet til 10 % for kortison og 15 % for kortisol. For kvantitative analyser av kortison og kortisol i fiskeskjell ble også god linearitet oppnådd (R2 ≥ 0,97). LOD for kortison og kortisol ble bestemt til henholdsvis 0,18 ng/g og 0,11 ng/g. LOQ for kortison og kortisol ble bestemt til henholdsvis 0,62 ng/g og 0,36 ng/g. Det ble påvist matrikseffekter i fiskeskjell ved økning i signal for kortison og hemming av signal for kortisol. Metodens riktighet ble beregnet ved gjenfinning (%) og ble beregnet til 74- 89 % for kortison og 71- 92 % for kortisol. Det ble oppnådd veldig høy til høy korrelasjon mellom væskekromatografi med høytoppløsende MS (LC-HRMS) og enzymkoblet immunadsorberende analyse (ELISA) i matriksene plasma og overflateslim. Det ble oppnådd ubetydelig korrelasjon mellom plasma og overflateslimprøver fra samme individ analysert med ELISA og LC-HRMS.

Farming of Atlantic salmon (Salmo salar) has been a large and important industry in Norway for a long time. In this time, the fish farming industry has experienced problems with various diseases that have led to high mortality. In recent times, the focus on good fish welfare and sustainability has increased. In the research project BioDirect, research is carried out on various diagnostic tools that can quickly and accurately detect disease based on various biomarkers that are secreted by the individual in the event of negative external influences. Research is also being carried out into the establishment of bioassays, which in the future may replace experiments on animals. By using biomarkers, it is possible to obtain information about diseases and the health of the fish from various matrixes such as blood, mucus and feces. Based on this, the molecular composition of these matrices can provide information about the animal's state of health. In this way, diseases can be diagnosed quickly, as well as clarify the impact of the external environment. This thesis focuses on quantitative analysis of cortisone and cortisol biomarkers for stress for Atlantic salmon. Chronic stress can adversely affect salmon by suppressing the salmon's immune system, and in this way increase susceptibility to diseases that can lead to death. It is also a challenging task to interpret the welfare of the salmon because the salmon does not give a direct expression to well-being and welfare. It is important to practice good fish welfare for ethical and quality reasons.