Fungicide resistance and resistance dynamics in Botrytis populations in Norway

Abstract

Grey mould, caused by Botrytis spp., causes serious losses in agriculturally and economically important crops worldwide. Growers in Norway have experienced grey mould control problems, and fungicide resistance in the pathogen was suspected. Botrytis is notorious for developing fungicide resistance, and growers’ main control method is application of single-site fungicides which are inherently at risk for resistance development. The aim of this work was to quantify resistance in the grey mould pathogen, identify Botrytis species, and gain a better understanding of resistance dynamics of Botrytis in strawberry (Fragaria × ananassa), raspberry (Rubus idaeus), and Norway spruce (Picea abies).

Results from in vitro resistance testing revealed high levels of resistance to boscalid, fenhexamid, and pyraclostrobin in Botrytis isolates obtained from strawberry fields in Agder, Norway in 2016. Detection of mutations in the respective target-genes (sdhB, erg27, and cytb) corroborated results from resistance testing. Results also showed mutations leading to the N230I and P225F substitutions in SdhB were present, indicating the genetic potential for resistance to the SDHI fluopyram existed in Botrytis in strawberry field populations before the fungicide was approved for use in Norway. In vitro resistance testing of Botrytis isolates from Norway spruce showed a moderate level of resistance to fenhexamid and high resistance to thiophanatemethyl, both commonly used fungicides for grey mould control in forest nurseries. Detection of mutations in the erg27 and tubA genes largely corroborated these results.

Testing of Botrytis from both imported and domestically produced strawberry transplant samples revealed a trend for higher levels of resistance in Botrytis from imported samples, but there were several examples of high resistance from domestic sources as well. Our results confirmed transplants as an important source of fungicide-resistant inoculum in strawberry production. Fungicide-resistant Botrytis was obtained from the air, surfaces, and weeds at forest nursery facilities. Weeds in particular can serve as reservoirs where Botrytis can continue to produce inoculum and infect new rounds of production if not removed.

The majority of Botrytis isolates from strawberry, Norway spruce, and forest nursery facilities were Botrytis cinerea. Only a few isolates obtained from strawberry were Botrytis pseudocinerea, a known member of the Botrytis species complex in this host. Botrytis pseudocinerea was also isolated from Norway spruce, which has not previously been documented, and a pathogenicity test confirmed its ability to infect Norway spruce seedlings. Botrytis prunorum was identified for the first time in northern Europe in samples obtained from the air in a forest nursery.

Results from an experimental strawberry field gave a strong indication of potential fitness cost associated with fungicide resistance. Monitoring results from commercial raspberry fields, however, detected overall minimal changes in fenhexamid resistance frequencies when growers discontinued use. This was likely due to other fungicides selecting for multiple fungicide resistance genotypes. Multiple fungicide resistance was observed often in resistance testing results in this study and represents a serious threat to the viability of chemical control as an effective grey mould disease control method in the future. The technique of using steam thermotherapy to reduce Botrytis infections in strawberry transplants was effective and has potential applications in other production systems. Cultural and other nonchemical methods will be important for future grey mould control. Examples of strawberry fields where low grey mould problems were reported despite high resistance show control of grey mould is possible.

Gråskimmel, forårsaket av sopper innen slekten Botrytis, er kjent for å forårsake betydelige avlingstap i viktige plantekulturer verden over. Dyrkere i Norge har hatt utfordringer med å bekjempe gråskimmel, og det har vært pekt på at fungicidresistens hos patogenet kan være en årsak. Botrytis er kjent for å utvikle resistens mot fungicider. Dyrkere er avhengige av fungicider med god virkning mot soppen. Målet med dette arbeidet var å undersøke resistens hos gråskimmelsoppen, identifisere Botrytis-arter, og utforske resistensdynamikk hos Botrytis i jordbær (Fragaria × ananassa), bringebær (Rubus idaeus), og gran (Picea abies).

Resultater fra in vitro resistenstesting viste høye nivåer a resistens mot virkestoffene boskalid, fenheksamid, og pyraklostrobin hos Botrytis i prøver fra jordbærfelt i Agder, Norge, i 2016. Det ble også påvist mutasjoner i mål-genene til virkestoffene (sdhB, erg27, og cytb) som var i samsvar med resultatene fra in vitro testingen. Testene viste også at N230I- og P225-substitusjonene i SdhB proteinet var til stede allerede da, noe som betyr at det genetiske bakgrunnen for resistens mot fluopyram var til stede i feltpopulasjoner i jordbær allerede før dette virkestoffet ble godkjent for bruk i Norge. Et moderat nivå av resistens og høyt nivå av resistens mot henholdsvis fenheksamid og tiofanatmetyl ble påvist hos gråskimmel fra gran. Påvisning av mutasjoner i erg27 og tubA genene var for det meste i samsvar med resistenstestresultater.

Testing av gråskimmel fra importerte og norskproduserte småplanteprøver av jordbær viste en tendens til mer resistens i gråskimmel fra importerte prøver, men det var flere eksempler på høy resistens i gråskimmel fra norsk-produserte planter også. Undersøkelsene våre bekrefter at småplanter er en viktig kilde til fungicidresistent smitte i jordbærproduksjon. Det ble også påvist fungicidresistens hos gråskimmel fra luft, overflater, og ugras i planteskoler. Spesielt ugras kan være en vertsplante der Botrytis kan overleve og fortsette å produsere smitte som kan infisere nye hold dersom den ikke blir fjernet.

De fleste isolatene fra jordbær, gran, og planteskoler var Botrytis cinerea. Noen få isolater fra jordbær var Botrytis pseudocinerea, som er kjent for å være en del av Botrytis-artskomplekset i jordbær. Botrytis pseudocinerea ble også isolert fra gran, noe som er ikke dokumentert før. I smitteforsøk viste denne soppen evne til å infisere frøplanter av gran. Botrytis prunorum ble identifisert for første gang i Norden, fra luft i en planteskole.

Resultater fra et forsøksfelt med jordbær ga en sterk indikasjon at det er mulig «fitness cost» tilknyttet fungicidresistens. Resultater fra overvåkning av kommersielle bringebærfelt, derimot, viste generelt lite endring i resistens mot fenheksamid etter at dyrkerne sluttet å bruke fungicidet. Dette kan trolig knyttes til seleksjon av multiresistente genotyper som følge av bruk av andre fungicider. Multiresistens ble observert ofte i dette arbeidet med testing av resistens, og representerer en trussel mot effektiv bekjemping av gråskimmel ved hjelp av kjemiske midler. Behandling med vanndamp for å redusere Botrytis i småplanter av jordbær hadde god effekt og det finnes muligheter for å anvende denne metoden også i andre produksjonssystemer. Kulturtiltak og andre ikke-kjemiske metoder er viktig for fremtidig bekjempelse av gråskimmel. Eksempler fra jordbærfelt der dyrker rapporterte liten grad av gråskimmelangrep til tross for stor grad av fungicidresistens viser at kontroll av gråskimmel er mulig.