Vis enkel innførsel

dc.contributor.advisorMathiesen, Geir
dc.contributor.advisorWiull, Kamilla
dc.contributor.advisorEjsink, Vincent
dc.contributor.authorLjosland, Anna Bakke
dc.date.accessioned2022-03-07T14:22:15Z
dc.date.available2022-03-07T14:22:15Z
dc.date.issued2021
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/11250/2983521
dc.description.abstractLactic acid bacteria (LAB) are widely used by humans for food production and preservation, and many LAB are natural inhabitants of the human gastrointestinal tract (GIT). For these reasons, LAB are generally recognized as safe for human consumption. The present study is part of a larger research project where the long-term goal is to develop a mucosal vaccine by utilizing the lactic acid bacterium Lactiplantibacillus plantarum as a delivery vehicle. This can be achieved by anchoring the relevant antigens on the surface of L. plantarum. The aim of this thesis was to anchor and display Invasin on the cell surface of L. plantarum by exploiting homologous N-terminal transmembrane proteins. Invasin, which is a virulence factor from the pathogen Yersinia pseudotuberculosis, can also be used as an adjuvant. This is because display of Invasin on the cell surface of LAB that are used as delivery vehicles can give these bacteria an increased possibility to enter organized lymphoid tissues associated with the small intestine. N-terminal transmembrane proteins are composed of a short N-terminal, intracellular region followed by a transmembrane helix and a C-terminal, extracellular region. To gain insight into proteins that could be well-suited as anchors for Invasin, it was performed an in-silico analysis of all predicted N-terminal transmembrane proteins in L. plantarum WCFS1. Based on the results of these analyses, six candidate proteins were selected to be used to construct anchors for Invasin. Six anchors with the full N-terminal, anchor region of the protein were made. For three of the anchors, it was also constructed truncated anchors which lacked the intracellular region. All the anchor sequences were translationally fused to Invasin and cloned into the inducible pSIP expression system. Six of the nine plasmids were successfully constructed and transformed into L. plantarum. The recombinant L. plantarum strains were characterized through growth analyses, western blot, and flow cytometry. In the flow cytometry analyses, it was detected clear fluorescent shifts for the three strains pLp_1751Inv, pLp_2132Inv and pLp_1751Short Inv compared to the negative control strain (pEV). This indicated that Invasin was displayed on the cell surface of these strains. After induction of gene expression, all the recombinant strains showed only a low or moderate reduction in growth, except for pLp_1751Inv, which showed a strong reduction in growth. This is also an indication that this strain produced Invasin. Based on the results obtained in this study, pLp_1751Inv appears to be the most promising strain for anchoring and display of Invasin on the cell surface of L. plantarum. It can therefore be interesting to investigate pLp_1751Inv in future studies.en_US
dc.description.abstractMelkesyrebakterier benyttes i stor grad av mennesker for produksjon og konservering av matvarer, og mange melkesyrebakterier er en naturlig del av menneskers tarmflora. Melkesyrebakterier regnes derfor generelt som trygge å konsumere for mennesker. Denne studien er del av et større forskningsprosjekt hvor det langsiktige målet er å utvikle en slimhinnevaksine for mennesker ved å benytte melkesyrebakterien Lactiplantibacillus plantarum som leveringsvektor. Dette kan oppnås gjennom forankring av relevante antigener på overflaten av L. plantarum. Hensikten med denne oppgaven var å forankre og uttrykke Invasin på overflaten av L. plantarum ved bruk av homologe N-terminale transmembranproteiner. Invasin, som er en virulensfaktor fra den sykdomsfremkallende bakterien Yersinia pseudotuberculosis, kan også fungere som en adjuvant. Årsaken til dette er at Invasin som uttrykkes på overflaten av LAB som brukes som leveringsvektorer kan gi disse bakteriene en større mulighet til å få tilgang til det organiserte lymfesystemet rundt tynntarmen. N-terminale transmembranproteiner inneholder en kort N-terminal, intracellulær del, etterfulgt av en transmembranheliks og en C-terminal, ekstracellulær del. For å få innsikt i hvilke proteiner som kunne være velegnede som ankre for Invasin ble det utført en in-silico-analyse av alle predikerte N-terminale transmembranproteiner i L. plantarum WCFS1. Basert på resultatene av disse analysene ble det valgt ut seks kandidatproteiner som skulle brukes til å konstruere ankre for Invasin. Det ble laget seks ankre som inneholdt den N-terminale, intracellulære delen av proteinet. For tre av kandidatproteinene ble det også laget kortere ankre som manglet den intracellulære delen. Alle ankersekvensene ble translasjonelt fusjonert til Invasin og klonet inn i det induserbare pSIP-ekspresjonssystemet. Seks av ni plasmider ble suksessfullt konstruert og transformert inn i L. plantarum. De rekombinante L. plantarum-stammene ble karakterisert gjennom vekstanalyser, western blot og flow cytometri. I flow cytometri-analysene ble det detektert tydelige fluorescenssignaler for de tre stammene pLp_1751Inv, pLp_2132Inv og pLp_1751Short Inv sammenliknet med den negative kontrollstammen (pEV). Dette indikerte at disse stammene uttrykte Invasin på celleoverflaten. Etter induksjon av gen-ekspresjon viste alle de rekombinante stammene kun en lav til moderat vekstreduksjon, med unntak av pLp_1751Inv som viste en kraftig reduksjon i veksten, noe som også tyder på at denne stammen produserte Invasin. Basert på resultatene av denne studien virker pLp_1751Inv som den mest lovende stammen for forankring og uttrykk av Invasin på celleoverflaten av L. plantarum. Det kan derfor være interessant å undersøke pLp_1751Inv i fremtidige studier.en_US
dc.language.isoengen_US
dc.publisherNorwegian University of Life Sciences, Åsen_US
dc.rightsAttribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internasjonal*
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/deed.no*
dc.titleAnchoring of invasin on the surface of Lactiplantibacillus plantarum exploiting homologous N-terminal transmembrane proteinsen_US
dc.typeMaster thesisen_US
dc.description.localcodeM-BIOTEKen_US


Tilhørende fil(er)

Thumbnail

Denne innførselen finnes i følgende samling(er)

Vis enkel innførsel

Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internasjonal
Med mindre annet er angitt, så er denne innførselen lisensiert som Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internasjonal