Tilapia Lake Virus (TiLV) : development of PCR-based diagnostic assays and insights into infection mechanisms

Abstract

Tilapia lake virus (TiLV) is an emerging virus of wild and farmed tilapiines responsible for causing mortalities and significant economic losses to the aquaculture industry. Since its first report in Israel, the virus has been reported in four continents (Asia, Africa, South and North America) to cause mortalities ranging from the lower extreme of 5-20% and higher extremes of up to 90%. The infection status in many countries is not yet known and implementation of surveillance programs has been recommended. Lake Victoria was selected for TiLV surveillance because it contains a large number of tilapiine species of economic importance to the surrounding East African countries. Well-optimized tools for rapid detection and quantification of the virus are also needed. Moreover, the mode of virus uptake in cells and importance for replication is not known. Therefore, this thesis aimed at understanding the possible presence of TiLV in Lake Victoria in East Africa, to develop tools for detection and quantification of the virus and to shed light of virus uptake mechanisms in permissive cells in vitro. In this thesis, a standard RT-PCR and a quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR) were developed based on all the ten segments of TiLV. The standard PCR was used to screen Nile tilapia (Oreochromis niloticus) from Lake Victoria in Eastern Africa. The quantitative real-time RT-PCR was developed based on virus supernatant of known titre and against samples of unknown virus titre originating from infected TFC #10 cells and fish organs. The virus’ ability to hemagglutinate avian and piscine erythrocytes was assessed, and the modulation of ammonium chloride on uptake and replication of TiLV in E-11 cells was studied. The findings reported in study I showed that primers designed from segment two of TiLV for a standard RT-PCR were the best at detecting TiLV in the infected cells and Nile tilapia organs. TiLV genome was detected in 28 Nile tilapias (14. 66%, N = 191) in which 17.78% (N=45) were from wild fish and 13.70% (N=146) from farmed fish (cage farming). The genomes of circulating TiLV in Nile tilapia from Lake Victoria were identical to those detected from Israel (98%), Ecuador (98%), Thailand (96%), Peru (96%) and USA (97%). TiLV was not grown from infected fish and thus its ability to cause disease in Nile tilapia was not studied. Therefore, I am recommending further studies to fulfil Koch’s postulates.

The data reported in study II showed that the developed and optimized quantitative real-time RT-PCR detected TiLV in virus supernatants of known titre and in organs of unknown titre from infected Nile tilapia. The developed assay is sensitive and specific to TiLV with all the primers efficiency being within the range of 95-105%, except primers targeting segment ten that gave an efficiency of 93%. The intra- and inter-assay coefficient of variation ranged between 0.00% ~ 2.63% and 0.00% ~ 5.92%, respectively, which is within the recommended range (below 5%) for an assay to be repeatable and reproducible. The detection limit of 2 TCID50/ml was found for primers targeting segments 1, 2, 3, 4 and 9 while lower detection limit of 20 TCID50/ml was found for primers targeting segment 5, 6, 7, 8 and 10. Overall primers targeting segment 3 had the highest detection limit and primers targeting segment 7 had the lowest detection limit. Interestingly, despite the two primer sets (for segment 3 and 7) having different TiLV detection limits they had an equal amplification efficiency of 98%. Therefore, primer optimization for qRT-PCR is important to optimize assay sensitivity. The study reported in paper III was directed at understanding the hemagglutination property of TiLV using avian and piscine erythrocytes, and the infection mechanisms in E-11 cells. TiLV did not hemagglutinate erythrocytes from any of the species tested indicating that the virus lack hemagglutinin. Further, the study has shown that ammonium chloride does not affect the replication of TiLV in E-11 cells indicating that the virus is not using the endocytic pathway during internalization. Taken together, the two observations suggest that, TiLV is not taken up by receptor-mediated endocytosis during internalization into E-11 cells. Thus, further studies are needed to unravel the uptake mechanism(s), which is the important information for controlling the virus by antiviral agents or immunoprophylaxis.

Tilapia lake virus (TiLV) er et fremvoksende virus som infiserer ville arter og oppdrettsarter av tilapia og gir dødelighet og betydelige økonomiske tap i oppdrett. Siden den første beskrivelsen av sykdommen fra Israel, har viruset blitt påvist på fire kontinenter (Asia, Afrika, Sør- og Nord-Amerika) og gir dødelighet fra 5-20% opp mot 90%. Forekomst av viruset er ikke kjent i mange av de landene som driver tilapiaoppdrett, og det er nødvendig å etablere bedre overvåknings- og kontrollprogrammer i disse landene. I denne studien ble Lake Victoria valgt for TiLV-screening fordi den inneholder et stort antall tilapia-arter som er av økonomisk betydning for de omkringliggende østafrikanske landene. Det er også behov for optimaliserte metoder for rask deteksjon og kvantifisering av viruset. Hvordan viruset tas opp i cellene og hvordan det replikerer er ikke kjent. I denne avhandlingen ble det gjennomført studier for å forstå forekomst av TiLV i Lake Victoria i Øst-Afrika, det ble etablert verktøy for påvisning og kvantifisering av viruset med molekylærbiologiske metoder, og det ble gjennomført studier for å bedre forstå opptaksmekanismer i celler under infeksjonen. Det ble utviklet en standard RT-PCR og en kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR) basert på alle de ti segmentene til viruset. Standard PCR ble brukt til å undersøke Nile tilapia (Oreochromis niloticus) fra Victoriasjøen. Den kvantitative RT-PCR metoden ble testet mot kjent og ukjent virustiter fra henholdsvis infiserte TFC# 10 celler og organer fra infiserte fisk. Hemagglutinering av røde blodlegemer fra hønsefugl og fisk ble også undersøkt, samt effekten av ammoniumklorid på replikasjonen av TiLV i E-11-celler. Resultatene i studie I viste at primere designet fra segment 2 benyttet for påvisning med standard RT-PCR var best egnet til å påvise TiLV i infiserte cellene og organer fra infisert fisk. TiLV fra Victoriasjøen ble påvist i 28 fisk (14. 66%, N = 191) hvor 17,78% (N = 45) var fra villfisk og 13,70% (N = 146) fra oppdrettsfisk. De sekvensene som ble påvist i Nil-tilapia fra Victoriasjøen var tilnærmet identiske med de som ble påvist i Israel (98%), Ecuador (98%), Thailand (96%), Peru (96%) og USA (97%). TiLV ble ikke dyrket eller testet med tanke på virulens/evne til å forårsake sykdom i Nil-tilapia, og derfor anbefaler jeg videre studier for å oppfylle Kochs postulater. I studie II ble det etablert en ny og optimalisert kvantitativ RT-PCR metode for påvisning av TiLV genom i prøver fra infiserte celler med kjent titer (mengde virus) og fra organer fra infisert Nil-tilapia uten kjent titer. Metoden som ble utviklet er sensitiv og spesifikk for TiLV, og primer-effektiviteten var innenfor et akseptabelt område, 95-105%, bortsett fra primere rettet mot segment 10 (93%). Variasjonskoeffisienten for intra- og inter-analyse varierte mellom henholdsvis 0,00% ~ 2,63% og 0,00% ~ 5,92%, som er innenfor det anbefalte området (under 5%) for at en analyse skal anses som repeterbar og reproduserbar. Sensitiviteten til metoden var 2 TCID50/ml, og primere spesifikke for segmentene 1, 2, 3, 4 og 9 gav samme resultat. En nedre deteksjonsgrense på 20 TCID50/ml ble påvist for primere rettet mot segment 5, 6, 7, 8 og 10. Primere spesifikke for mot segment 3 gav høyest sensitivitet og primere segment 7 den laveste. Begge primersettene hadde en effektivitet på 98%. I artikkel III var målsettingen å forstå hemagglutinasjonsegenskapen til TiLV ved bruk av erythrocytter fra hønsefugl, tilapia og laks, samt betydningen av endocytose i tidlig fase av infeksjonen i E-11-celler. TiLV gir ikke hemagglutinering av erytrocytter fra noen av de testede artene, noe som indikerer at viruset mangler hemagglutinin. Studien har også vist at ammoniumklorid ikke påvirker, dvs. hemmer eller forsinker replikasjonen av TiLV i E-11-celler, noe som indikerer at viruset ikke tas opp ved endocytose. Samlet antyder de to observasjonene at TiLV ikke blir tatt opp av reseptormediert endocytose i E-11-celler. De gjennomførte studiene viser at det er behov for å forstå opptaksmekanismen(e) til virus, som er en viktig informasjonen for å kontrollere virusinfeksjonen med anti-virale midler eller vaksiner.