Development, optimization and field testing of a filtration method for detection of salmonid alphavirus in seawater

Abstract

The commercial aquaculture is continuously growing with the demand for fish and seafood products. In Norway, Atlantic salmon (Salmo salar L.) constitute 94 % of the total aquaculture production, making it the most important species in Norwegian aquaculture. With the high demand of fish and fish products globally, the farming of salmonids continues to occur intensively. This result in fish being under constant threat of being infected by pathogens and suffer from different diseases. Pancreas disease (PD), caused by salmonid alphavirus (SAV), is a systemic disease and is considered among the most serious virus diseases in sea farmed salmonids with a negative impact on fish welfare. It is also one of the most economically important fish diseases in aquaculture in Europe. This disease was first reported in 1976 in Scotland and in the 1980s in Norway, where it became a notifiable disease (list 3) in 2007. In 2017, the national surveillance program for PD was intensified in Norway, introducing a PD zone for SAV2 and SAV3 (i.e. Western- and Mid-Norway), and two surveillance zones north and south/south-east of the PD zone. This was done as a way to reduce the consequences of the disease, as well as to prevent further spread of SAV within the defined zones. This surveillance program relies on a time-consuming and resourcedemanding approach, involving monthly sampling of at least 20 fish from all SAV-negative marine operative farm sites with salmonid fish, and analyzing heart tissue from each fish by RT-qPCR analysis. For years, significant progress has been made in developing filtration methods for concentrating low amounts of pathogens in water, and surveillance programs for different types of harmful pathogens have already been established based on a filtration technique. Hence, the focus of this study was to develop and optimize a filtration method for the detection of SAV in seawater, making the selective and invasive traditional testing of fish redundant. This study was divided into three steps; initially tested in vitro, followed by evaluation in a challenge model, and assessed under natural field conditions. The in vitro study was performed in order to test five combinations of two different electrocharged filters and four different buffer solutions for concentration and detection of SAV3 in seawater by spiking SAV3 into 1 L of artificial and natural seawater. The SAV3 was quantified by using RT-qPCR and RT-ddPCR in order to compare the SAV3 concentrations measured. In this study, the highest SAV3 recovery and efficiency was made when combining electronegative filter with lysis buffer, by RT-ddPCR and RT-qPCR analysis, with the former performing significantly better at higher dilutions. Following the in vitro study, a SAV3-cohabitant challenge trial using post-smolt Atlantic salmon, was carried out in order to evaluate the five concentration methods further. In this study, an electronegative filter combined with lysis buffer was the most suitable method for recovering SAV3 from seawater by RT-qPCR analysis. In addition, a positive correlation was found between SAV3 detections in cohabitant fish tissue and in water when using this concentration method. Further optimization and field testing of the filtration method for detection of SAV in seawater was with electronegative filter and elution with lysis buffer before sample analysis by RT-qPCR. Under the field conditions, early SAV-detections was made in seawater collected from inside net-pens compared to the monthly screening of fish. Higher SAV-recovery and early SAV detection were made in seawater compared to fish screening. This new method could be a more straightforward, cost-efficient, time-saving, resource-saving, and not the least animal welfare-friendly approach for virus surveillance, with a potential for earlier implementation of disease control measures that may be applied to detect other fish pathogenic viruses than SAV. Moreover, it could also allow assessment of viral transmission and disease dynamics in fish farms. Let’s dive in!

Den kommersielle akvakulturen vokser kontinuerlig med etterspørselen etter fisk og sjømatprodukter. I Norge utgjør 94% av det totale havbruket av atlantisk laks (Salmo salar L.), noe som gjør den til den viktigste arten i norsk havbruk. Med den høye etterspørselen etter fisk og fiskeprodukter globalt sett, fortsetter lakseoppdretten på en intensiv måte. Dette fører til at fisk konstant trues av å bli smittet og lide av forskjellige sykdommer. Pankreas sykdom (PD), som er forårsaket av salmonid alphavirus (SAV), er en systemisk sykdom som regnes som en av de mest alvorlige virussykdommene som også påvirker fiskevelferden negativt hos oppdrettslaksen. Det er også en av de mest økonomiskt viktige fiskesykdommene innen havbruk i Europa. Denne sykdommen ble først rapportert i 1976 i Skottland og på 1980-tallet i Norge, hvor den ble en meldepliktig sykdom (liste 3) i 2007. I 2017 ble det nasjonale overvåkingsprogrammet for PD intensivert i Norge, med innføring av en PD-sone for SAV2 og SAV3, og to overvåkingssoner nord og sør/sør-øst om PD-sonen, for å redusere konsekvensene av sykdommen innenfor de definerte sonene, samt for å forhindre videre spredning av SAV. Dette overvåkingsprogrammet er avhengig av en tidkrevende og ressurskrevende tilnærming, som involverer månedlig prøvetaking av minst 20 fisk fra alle SAV-negative operative sjøvannsanlegg for salmonide fisker, og analyse av hjertevev fra hver av disse fisker ved RT-qPCR analyse. Gjennom årene har det blitt gjort noen betydelige fremskritt i utviklingen av filtreringsmetoder for å konsentrere lave mengder patogener i vann, og overvåkingsprogrammer for forskjellige skadelige patogener er allerede etablert basert på denne teknikken. Dermed var fokuset for denne studien å utvikle og optimalisere en filtreringsmetode for påvisning av SAV i sjøvann, noe som gjør selektiv og invasiv tradisjonell testing av fisk overflødig. Denne studien ble delt inn i tre trinn; opprinnelig testet in vitro, etterfulgt av evaluering i en smitteforsøksmodell, og til sist vurdert under feltforhold. In vitro studien ble utført for å teste fem kombinasjoner av to forskjellige elektroladet filtre, og fire forskjellige bufferløsninger for konsentrasjon og påvisning av SAV3 i sjøvann, ved å tilføye SAV3 i 1 liter kunstig og naturlig sjøvann. SAV3 ble kvantifisert ved bruk av RT-qPCR og RT-ddPCR for å sammenligne de målte konsentrasjonene. I denne studien ble de høyeste konsentrasjonene og effektiviteten av SAV3 funne når man kombinerte elektronegativt filter med lyseringsbuffer, ved RT-ddPCR og RT-qPCR-analyse, hvor den førstnevnte presterte betydelig bedre ved høyere fortynninger. Etter in vitro studien ble det utført en SAV3-kohabitant smitteforsøk med post-smolt atlantisk laks for å evaluere de fem konsentrasjonsmetodene. Også i denne studien var elektronegativt filter kombinert med lyseringsbuffer den mest egnede metoden for å påvise SAV3 fra sjøvann ved bruk av RTqPCR. I tillegg ble det funnet en positiv korrelasjon mellom SAV3-påvisninger i kohabitant fiskevev og i vann, ved bruk av denne konsentrasjonsmetoden. Ytterligere optimalisering og feltprøving av filtreringsmetoden for påvisning av SAV i sjøvann var med elektronegativt filter og eluering med lyseringsbuffer, før prøveanalyse ved RT-qPCR. Under feltforhold, ble tidlig SAV-påvisning gjort i sjøvann oppsamlet fra innsiden av merdkanten sammenlignet med månedlig screening av fisk. Det ble også avdekket høyere SAV-konsentrasjoner og effektivitet, og tidligere SAV-påvisning i vann sammenlignet med screeninganalyse av fiskevev. Denne nye metoden kan være en mer rett frem, kostnadseffektiv, tidsbesparende, ressursbesparende og ikke minst dyrevelferdsvennlig tilnærming for virusovervåking, med potensial for tidligere implementering av sykdomskontrolltiltak og med mulighet for å oppdage andre fiskepatogene virus enn SAV. Videre kan det også tillate vurdering av virusoverføring og sykdomsdynamikk i oppdrettsanlegg. La oss hoppe i det!