Cloning and characterization of Cas9 in IPEC-J2 cells for CRISPR screens against porcine E. coli pathogen
Master thesis
View/ Open
Date
2021Metadata
Show full item recordCollections
- Master's theses (IPV) [240]
Abstract
Bakgrunn
Svin er ofte brukt husdyr i landbruket, brukt primært for dets kjøtt. Et ofte forekommende problem i svineindustrien er diare forårsaket av bakterier, hvor enterotoksinproduserende Escherichia coli(ETEC) er en av de største bidragsyterene. Den fester seg til tarmveggens epithel celler via reseptorer på celleoverflaten med fimbriae og skiller ut enterotoksin som forårsaker diare.
Resultater
I denne master oppgaven så er målet å teste gjennomførbarheten av en CRISPR knockout skjerm av IPEC-J2 celler for resistens gener mot F4 ETEC. CRISPR/Cas9 ble levert inn i cellene av lentivirus, gjort om til celle linjer og tested for ekspresjon av Cas9. Guide RNA ble designet for å bli brukt mot kjente resistens gener mot ETEC: MUC4, MUC13 og FUT1. 8 Forskjellige transduserte IPEC-J2 cellelinjer med forskjellige nivåer av Cas9 utrykkelse ble valgt og hadde en gRNA levert via lentivirus for å utføre en deaktivering av MUC4 genet. I tillegg ble et eksperiment utført for å evaluere om propidiumjodid kan brukes for å teste endring i celle permeabiliteten til IPEC-J2 celler påvirket av ETEC.
The transduction proved to be successful with little optimization. Creation of cell lines were difficult, but a change in method showed improved results. Both qPCR and western blot was used to evaluate mRNA and protein expression, which showed the transduced IPEC-J2 cell lines having a wide range of Cas9 expression. This proves that IPEC-J2 cells can used for a crispr screen. Propidium iodide proved to be a bad tool for testing phenoptype in an eventual phenotype test for ETEC.
Konklusjon
Transduskjonen viste seg å være vellykket med lite behov for optimalisering. Opprettelsen av celle linjer var utfordrene, men en endring i metode ga forbedrede resultater. Både qPCR og western blot ble brukt for å evaluere mRNA og protein produksjon nivåer, som viste at de transduserte IPEC-J2 cellene hadde en bred variasjon av Cas9 uttrykkelse. Dette viser at IPEC-J2 celler kan bli brukt for CRISPR skjerming. Propidiumjodid viste seg å være en dårlig verktøy for å teste fenotype i en eventuell fenotype test for ETEC effekt på IPEC-J2 celler.