Detection and viability assessment of foodborne parasites of public health importance on berries

Abstract

Foodborne parasites (FBP) are public health concern throughout the world causing significant effects on the health and wellbeing of people. Despite the tremendous impact of FBP, the relative attention paid to avert their transmission has been rather scanty, and there is a lack of standardized methods that could be used for risk assessment. A wide range of parasites are potentially transmitted via contaminated fresh produce, including berries. These FBP shows diversity in many ways, including their biological makeup, life cycle, and pathogenicity. The physical properties of the transmission stages also differ, which makes development of a universal method for detection challenging. Despite the growing number of laboratory methods developed for the detection of foodborne pathogens, the case of parasites is still lagging compared to bacteria and viruses. The lack of standard methods developed for detection of most FBP means that there is very little surveillance of berries for parasite contamination. Furthermore, there are no validated methods to assess the viability of parasites identified as contaminants of berries. The ‘gold standard’ method for assessing the infectivity of parasites is by using animal bioassay. However, this is time consuming, labour intensive, ethically challenging, and not applicable for parasites that are host specific. The present PhD project was aimed at developing novel methods for the detection and viability assessment of parasite contaminants of berries. The study focused on molecular methods, i.e. quantitative PCR (qPCR) for detection and reverse transcription qPCR (RT-qPCR) for viability assessment. The study resulted in the development of a novel molecular method for the simultaneous detection of Echinococcus multilocularis, Toxoplasma gondii, and Cyclospora cayetanensis as contaminants of berries. Surveillance of berries for parasite contaminants using the methods developed showed that berries sold in the market stores of Norway were contaminated with Toxoplasma (3 %) and Cyclospora (< 1 %). No E. multilocularis was detected. Furthermore, the study also investigated the removal efficiency of different berry washing techniques. The results of the investigation showed that washing the berries under running water for 1 min could remove at least 80 % of contaminating parasites except Cyclospora cayetanensis. The use of salad spinner showed better removal efficacy and using one-part vinegar to 3-part water for washing the berries were even more effective in removing parasites. Efforts were made to develop methods for viability assessment of T. gondii and C. cayetanensis. But due to lack of availability of viable oocysts of these parasites, Cryptosporidium parvum was used as a surrogate instead. Therefore, a novel RT-qPCR method was developed for the assessment of viability of Cryptosporidium oocysts. The novel RT-qPCR could be employed to evaluate the inactivation efficacy of different treatments that could be used by the fresh produce industry. In conclusion, novel methods that could be used in the surveillance of berries for parasite contamination were developed, evaluated, and applied. The development of novel RT-qPCR for viability assessment of Cryptosporidium oocysts paved the way for developing similar methods for T. gondii and C. cayetanensis.

Matbårne parasitter (MBP) er en utfordring for folkehelsen over hele verden og forårsaker betydelige effekter på menneskers helse og velvære. Til tross for de enorme samfunnsmessige innvirkningene MPB kan ha så har innsatsen for å hindre deres overføring vært sparsom, og det er foreløpig mangel på standardiserte metoder som kan brukes til risikovurdering. Et bredt spekter av parasitter kan potensielt overføres via kontaminerte ferske råvarer, inkludert bær. Disse er forskjellig på mange måter, inkludert deres biologiske sammensetning, livssyklus og evne til å forårsake sykdom. De fysiske egenskapene til overføringsstadiene er også forskjellige, noe som gjør det utfordrende å utvikle universelle påvisningsmetoder. Til tross for et økende antall laboratoriemetoder som har blitt utviklet for påvisning av matbårne patogenere, så er det relativt få metoder som fokuserer på parasitter, sammenlignet med bakterier og virus. Mangelen på standardiserte metoder rettet mot påvisning av de fleste MBP har ført til at det er veldig lite overvåking av bær for kontaminering med parasitter. Videre er det ingen validerte metoder for å vurdere levedyktigheten til parasitter som kan overføres med bær. Infeksjonsstudier med forsøksdyr har så langt vært gullstandarden for å vurdere parasittenes evne til å forårsake infeksjon. Denne fremgangsmåten er imidlertid tid- og arbeidskrevende, etisk utfordrende og ikke aktuelt for parasitter som er spesifikke for mennesker. Dette PhD-prosjektet var rettet mot å utvikle nye metoder for påvisning og levedyktighetsvurdering av parasitter som kan overføres med bær. Studien fokuserte på molekylære metoder, dvs. kvantitativ PCR (qPCR) for påvisning og revers transkripsjon qPCR (RT-qPCR) for levedyktighetsvurdering. Dette resulterte i en ny molekylær metode for samtidig påvisning av Echinococcus multilocularis, Toxoplasma gondii og Cyclospora cayetanensis som forurensninger av bær. Metoden ble deretter brukt i en studie der bær som var tilgjengelig på det norske markedet ble analysert. Studien avdekket kontaminering av bær med to av parasittene, henholdsvis T. gondii (3 %) og C. cayetanensis (< 1%), mens ingen av prøvene testet positivt for E. multilocularis. Videre ble også effektiviteten til å fjerne parasitter fra bær ved hjelp av ulike vaskemetoder sammenlignet. Resultatene fra forsøkene viste at skylling av bærene under rennende vann i 1 minutt kunne fjerne minst 80 % av parasittene unntatt C. cayetanensis. Ved bruk av en salatspinner eller en fortynnet eddikløsning så kan man for øvrig fjerne betraktelig flere parasitter fra overflaten til bær. Et av hovedmålene med dette prosjektet har vært å utvikle metoder for vurdering av levedyktig av T. gondii og C. cayetanensis. Men på grunn av mangel på levedyktige oocyster (overføringsstadiet) til disse parasittene, ble Cryptosporidium parvum brukt som et surrogat, og den nyutviklede RT-qPCR-metoden for vurdering av levedyktigheten er derfor basert på Cryptosporidium-oocyster. Prosjektet resulterte i utviklingen av en ny metode basert på komparativ omvendt transkripsjon qPCR (RT-qPCR) for vurdering av levedyktigheten til Cryptosporidium-oocyster. Den nye metoden kan brukes til å evaluere effektiviteten til ulike deaktiveringsprosesser som kan anvendes i ferskvarebransjen. Avslutningsvis ble de nye påvisningsmetodene, som skal kunne brukes til overvåking av bær for parasittkontaminering, evaluert og anvendt. Utviklingen av en ny RT-qPCR metode for vurdering av levedyktighet av Cryptosporidium-oocyster kan bane vei for utvikling av lignende metoder for T. gondii og C. cayetanensis.