The microbial diversity of mesophilic starter cultures used in cheese production

Abstract

For ages, humankind has preserved various foods by fermentation by lactic acid bacteria (LAB), and fermentation of milk to obtain cheese can be traced back to the domestication of cattle, at least seven millennia ago. An essential ingredient in contemporary production of Dutch-type cheeses are the undefined mixed mesophilic (DL) starter cultures, which contains unknown mixtures of Lactococcus lactis strains and Leuconostoc spp.. Bacteriophages infecting Lactococcus lactis, the major contributors in the acidification of milk using mesophilic starter cultures, are recognized as the major cause of fermentation failures in dairy fermentations, disrupting the acidification process and negatively affecting the quality of the final product. The undefined mixed (DL) starter cultures are considered more robust against phage attack than the defined cultures, a characteristic gained from their large number of strains with diverse phage sensitivity. Starter cultures from different manufacturers are known to give cheeses qualitatively different characteristics, and performance differences are reported for different batches of the same starter culture, which indicates dissimilar culture compositions. Information on the microbial diversity of starter cultures is not publically available and tools to quantify the strain diversity or compare compositional differences between starter cultures does not exist. The information provided by the culture manufacturer with culture purchase does not include details beyond genus for leuconostocs, or beyond subspecies for the lactococci. In this study, the diversity of bacteria and their bacteriophages in starter cultures and dairy samples collected from three major cheese plants in Norway was investigated using molecular and DNA-sequencing based approaches. Use of a milk based-medium (GMA) in addition to the traditional M17 was instrumental in capturing a larger diversity of bacteria from starter cultures, which consequently increased the capacity to isolate bacteriophages from the dairy samples. The bacteria and bacteriophages were discriminated from each other use phage typing, revealing a large number of different bacteria as well as different bacteriophages. Interestingly, many of the strains that were only able to grow in a milkbased media, demonstrated unique phage sensitivities. A large number of phenotypically different starter bacteria with dissimilar phage sensitivities were whole-genome sequenced and characterized in pan-genome analyses. Pan-genome analyses discriminated between 21 Lactococcus lactis subsp. lactis, 28 Lactococcus lactis subsp. cremoris, as well as 12 3 Leuconostoc spp. lineages. Interestingly, the analyses did not discriminate Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides from Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, and showed that genomic variation between the isolates was much greater than between the subspecies. The diversity of Lactococcus lactis of three DL starter cultures was analyzed by targeted-amplicon sequencing of 16S rDNA, the core gene purR, and the softcore gene epsD, present in over 95% of starter culture isolates, but absent in most of the reference strains. The results revealed significant differences between the three starter cultures as well as compositional shifts during cultivation in milk. Compositional analyses of the Leuconostoc population in the five DL starters by targeted-amplicon sequencing of eno, the gene encoding for enolase, also revealed significant differences between the cultures. Three of the cultures were dominated by Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris while Leuconostoc pseudomesenteroides dominated in the other two. Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides and subsp. dextranicum was found in all DL cultures, while Leuconostoc lactis, reported to be a major constituent in fermented dairy products, was only identified in one of the cultures. This work shows that starter cultures are different both with regards to both lactococci and leuconostocs, and provides tools to describe the microbial diversity of mesophilic starter cultures. The dairy industry and starter culture manufacturers can vastly improve their ability to monitor all phases of starter culture and cheese production by implementing the methods described in this work. Routine analysis of the microbial composition of starter cultures will enable quality control of starter cultures, and enable the industry to make competent decisions regarding starter culture rotations in the event of phage attack.

I årtusener har mennesker utnyttet melkesyrebakterier (LAB) til å konservere mat via fermentering. Produksjon av ost via fermentering av melk kan spores minst 7.000 år tilbake til domestiseringen av storfe. En essensiell ingrediens i moderne produksjon av gulost er starterkulturene, som oftest såkalt udefinerte mesofile blandingskulturer (DL) som inneholder et ukjent antall forskjellige Lactococcus lactis stammer og Leuconostoc spp.. Kjent som den hyppigste årsaken til fermenteringsfeil, er bakteriofager som angriper Lactococcus lactis, den viktigste bidragsyteren i forsuringen av melk ved bruk av mesofile starterkulturer. Bakteriofagangrep kan forstyrre forsuringsprosessen og redusere kvaliteten på sluttproduktet. Fordi de inneholder et stort antall stammer med ulik følsomhet for bakteriofager, anses de udefinerte blandingskulturene som mer robuste mot bakteriofagangrep enn definerte kulturer. Det er kjent at starterkulturer fra ulike produsenter gir ostene forskjellige kvalitetsmessige karakteristikker, en indikasjon på ulikheter i kulturkomposisjonen. Informasjon om den mikrobielle diversiteten i starterkulturene er ikke offentlig tilgjengelig og verktøy for kvantifisering av stammediversiteten eller for å sammenligne kulturkomposisjonen mellom kulturene eksisterer ikke. Kulturprodusentene oppgir ikke detaljer utover genus for Leuconostoc, eller utover underart for Lactococcus lactis. I denne studien har bakterie- og bakteriofag-diversiteten i starterkulturer og meieriprøver fra tre ulike store norske ysterier blitt undersøkt ved hjelp av molekylære og DNA-sekvenseringsbaserte metoder. Bruk av et melkebasert vekstmedium (GMA) i tillegg til det tradisjonelle vekstmediet M17 var avgjørende for å øke kapasiteten til å isolere en større diversitet av bakterier fra starterkulturene, som igjen førte til et større potensial for å isolere bakteriofager fra meieriprøvene. Ved hjelp av fagtyping ble et stort antall forskjellige bakterier og bakteriofager diskriminert fra hverandre. Et interessant funn var at mange av stammene som kun vokste på det melkebaserte mediet var følsomme for bakteriofag som M17-stammene ikke var følsomme for. Et stort antall fenotypisk forskjellige starter bakterier med ulik fagfølsomhet ble hel-genom sekvensert og karakterisert ved hjelp av pangenomiske analyser. Pan-genom analysene skilte bakteriene inn i 21 Lactococcus lactis subart lactis, 28 Lactococcus lactis subart cremoris, og 12 Leuconostoc spp. linjer. Analysen diskriminerte ikke Leuconostoc mesenteroides subart mesenteriodes fra 5 Leuconostoc mesenteroides subart dextranicum, og viste at den genomiske variasjonen mellom isolatene var mye større enn mellom subartene. Diversiteten av Lactococcus lactis ble undersøkt i tre DL starterkulturer ved «amplicon» sekvensering av 16S rDNA, «core»- genet purR, og «softcore»-genet epsD som var tilstede i over 95% av starterkultur isolatene, men var fraværende i flesteparten av referansestammene. Resultatene avslørte betydelige forskjeller mellom de tre starterkulturene og endringer i kulturkomposisjonen under kultivering i melk. Komposisjonsanalysen av Leuconostoc i fem DL starterkulturer ved «amplicon» sekvensering av eno, genet som koder for Enolase, et essensielt enzym i glykolysen avslørte også signifikante forskjeller mellom starterkulturene. Tre av kulturene var dominerte av Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris mens de to resterende kulturene var dominerte av Leuconostoc pseudomesenteroides. Et lavt antall av Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides and subsp. dextranicum ble identifisert i alle DL starterkulturene, mens Leuconostoc lactis, beskrevet i litteraturen som høyst relevant, ble kun identifisert i lave antall i en av kulturene. Dette arbeidet viser at mesofile starterkulturer er forskjellige, både med hensyn til laktokokker og leukonostokkene og inkluderer verktøy for å beskrive den mikrobielle diversiteten i mesofile starterkulturer. Ved å implementere metodene beskrevet i dette arbeidet kan meierinæringen og starterkulturprodusentene oppnå en betraktelig bedre evne til å overvåke alle faser av starterkultur og osteproduksjonen. Kvalitetskontroll av meieriproduksjonen ved å regelmessig analysere den mikrobielle komposisjonen i starterkulturene kan bidra til å redusere svinn, effektivisere produksjonen, og styrke evnen til å avgjøre hvilke kulturer som benyttes i produksjonen, samt hvilke kulturer som inkluderes i et rotasjonssystem, skulle produksjonen være utsatt for bakteriofagangrep.