Genetics of chronic subclinical mastitis in Norwegian Red cows

Abstract

Chronic subclinical mastitis is an udder inflammation widely defined as milk somatic cell count (SCC) above 200 000 cells/ml for a prolonged period of time, often caused by bacterial infection. Several authors have studied subclinical mastitis (SCM) with the purpose to identify underlying genetic predispositions, while in the case of chronic SCM to date only a few studies exist. Therefore, the genetic mechanisms associated with chronic SCM still remains to be identified. The present thesis focus on chronic SCM in the Norwegian Red (NR) population, aiming to identify underlying biological processes contributing to high SCC in milk. Firstly (Paper I), the available SCC phenotype records on NR cows in lactation 1 to 3 were used to estimate genetic parameters of novel defined chronic SCM traits and for lactation average somatic cell score (LSCS). Ten SCM traits were defined as binary and scored as 1 if two testday SCC in a row were above SCC thresholds from 50 000 to 400 000 cells/ml (SCM50, -100, -150, -200, -250, -300, -350, -400); and if three testday SCC in a row were above 200 000 and 400 000 cells/ml, respectively (SCM200_3, SCM400_3). Also the number of days before the first case with SCM50=1 (D50) or SCM400=1 (D400) were analysed. The estimated heritability of the SCM traits varied from 0.01 to 0.10 and for LSCS the heritability was 0.3. High genetic correlations were estimated between the alternative SCM traits, ranging from 0.7 to 1. The estimated genetic parameters from Paper I were used as input in a genome-wide association study (GWAS) together with genotype data from 3795 NR bulls (Paper II). The analyses were based on single nucleotide polymorphism (SNP) data from NR bulls and SCC records from their daughters (n=3 543 764). The GWAS detected 36 significant SNPs associated with one or more of the alternative SCM traits. Based on converted bovine topologically associated domain (TAD) regions with significant SNPs, 181 genes were identified and analysed by Ingenuity Pathway Analysis (IPA) in order to recognise involved canonical pathways and networks. Several significant pathways and putative candidate genes for the alternative SCM traits and for LSCS were identified, which illustrates the complexity of chronic SCM. A group of chemokine (C-X-C motif) ligand genes (CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL8) were found associated to SCM200_3, in addition to the Fos proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit (FOS), that was also found as a top significant gene for the traits SCM150, -200, -250, -300, -350, -400 and D400. Further, expression profiles of selected candidate genes identified in association with the chronic SCM traits, were analysed in samples of unstimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from twenty NR cows; ten cows with high and ten cows with low estimated genomic breeding value (GEBV) for LSCS (Paper III). Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) on isolated RNA revealed differences between the NR cows. Significantly higher expression level of the CXCL1 gene was found in unstimulated PBMC samples from the group of cows with high GEBV for LSCS compared to the group of cows with low GEBV. Higher expression of the CXCL1 gene may contribute to more rapid immune response, calling for more neutrophil cells when an invading pathogen enters the udder. In Paper IV, two groups of NR cows with high (n=6) or low (n=6) GEBV for LSCS were studied. Macrophages isolated from blood samples were challenged in vitro with the Streptococcus agalactiae strains ST12 or ST10. Challenge with the bacterial strains revealed 5936 and 6443 differentially expressed (DE) genes in the groups infected with ST103 or ST12, respectively, versus unchallenged controls. The results observed in Paper IV, indicates involvement of neutrophils in high SCC in milk during inflammation in the udder. Such as, the observed up-regulation of Myosin IF (MYO1F) in the ST103 infected macrophages from cows with low GEBV for LSCS, imply increased neutrophil migration in to the infected tissue, which may cause high SCC in milk. In summary, our study have contributed for better understanding of biological mechanisms underlying the development of chronic SCM in NR cattle. The defined alternative SCM traits are genetically different from the LSCS trait currently used in genetic evaluations for NR and can therefore add information in order to improve breeding for better udder heath. Moreover, the observed cellular expression profiles of genes involved in neutrophil influx indicates regulation of neutrophil movement as an important part of the biological mechanisms behind chronic SCM traits in NR and the number of somatic cells in milk.

Kronisk subklinisk mastitt defineres vanligvis som jurbetennelse med høyt celletall i melk (over 200 000 celler/ml) i en lengre periode, ofte forårsaket av en bakterieinfeksjon. Flere har analysert subklinisk mastitt (SCM) og brukt alternative definisjoner av egenskapen for å finne den genetiske bakgrunnen. Men for kronisk SCM finnes det per dags dato kun noen få studier der alternative definisjoner av egenskapen har blitt analysert. Kunnskapen om de genetiske mekanismene som styrer kronisk SCM er derfor fortsatt mangelfull. I denne studien har vi fokusert på kronisk SCM i Norsk Rødt Fe (NRF) populasjonen med mål om å identifisere grunnleggende biologiske prosesser som bidrar til høyt celletall i melk. I artikkel I, ble data for celletall (SCC) hos NRF kyr i laktasjon 1 til 3 brukt til å estimere genetiske parametere for 12 nye SCM egenskaper og for gjennomsnitt laktasjonscelletall (LSCS). Ti binære SCM egenskaper ble definert som 1 hvis SCC i melk to testdager på rad var høyere enn en gitt terskelverdi fra 50 000 til 400 000 celler/ml (SCM50, -100, -150, -200, -250, -300, -350, -400); og hvis SCC tre testdager på rad var over 200 000 og 400 000 celler/ml, henholdsvis (SCM200_3; SCM400_3). I tillegg ble antall dager før SCM50 (D50) eller SCM400 (D400) oppstår for første gang analysert. Den estimerte arvegraden for SCM egenskapene varierte fra 0,01 til 0,10 og for LSCS var den 0,30. Høye genetiske korrelasjoner, med variasjon fra 0,7 til 1, ble estimert mellom de 12 alternative SCM egenskapene. De estimerte genetiske parameterne ble videre brukt i artikkel II i en assosiasjonsstudie (GWAS) med genotypedata i form av enkeltbasepolymorfier (SNPer) for NRF okser (n=3795) og SCC fenotypedata for døtrene til oksene (n=3 543 764). Ved GWAS analysen ble 36 SNP–markører identifisert som signifikant assosiert med en eller flere av de alternative SCM egenskapene. Basert på konverterte topologiske områder (TAD) med signifikante SNPer i storfegenomet, ble 181 gener identifisert og analysert med Ingenuity Pathway Analysis (IPA) for å finne involverte biologiske prosesser og genetiske nettverk. Flere påviste likheter og forskjeller mellom de alternative SCM egenskapene illustrerer kompleksiteten til kronisk SCM. En gruppe av kjemokin (C-X-C motiv) ligand gener (CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL8) ble identifisert for SCM200_3 i tillegg til Fos proto-onkogen, AP-1 transkripsjonsfaktor subenhet (FOS). FOS genet ble også funnet som ett av de mest signifikante genene for SCM150, -200, -250, -300, -350, -400 og D400. Uttrykket av selekterte kandidatgener identifisert i forbindelse med de kroniske SCM egenskapene ble videre studert i ustimulerte perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra ti NRF kyr med høy genomisk avlsverdi (GEBV) for LSCS og ti kyr med lav GEBV for LSCS (artikkel III). Revers transkripsjon-kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) ble benyttet på RNA isolert fra de ustimulerte PBMC prøvene og forskjeller i genuttrykk ble påvist. Signifikant høyere ekspresjon av genet CXCL1 ble påvist i prøver fra kyr med høy GEBV sammenlignet med gruppen med lav GEBV. Høyere ekspresjonen av CXCL1 kan være med på å forklare bedre motstand mot kronisk SCM gjennom en raskere immunrespons ved å tilkalle flere nøytrofile granulocytter for å angripe invaderende patogener i juret. I artikkel IV ble grupper av NRF kyr med høy (n=6) eller lav (n=6) GEBV for LSCS studert. Makrofagceller isolert fra blodprøver ble i kultur (in vitro) infisert med Streptococcus agalactiae stammene ST12 eller ST103 i tillegg til ustimulerte kontrollprøver. Det ble funnet totalt 5936 og 6443 gener med signifikant forskjellig uttrykk i gruppene infisert med henholdsvis ST103 og ST12 sammenlignet med ustimulerte kontrollprøver. Resultatene i artikkel IV indikerer at nøyrofile granulocytter er involvert i økt SCC i melk ved en inflammasjon i juret. For eksempel opp regulering av Myosin IF (MYO1F) genet i ST103 infiserte makrofager fra kyr med lav GEBV for LSCS antyder øket tilstrømning av nøytrofile granulocytter til infisert vev og kan dermed bidra til høyere SCC i melk. Kort oppsummert har denne avhandlingen bidratt til en bedre forståelse av de biologiske mekanismene som ligger til grunn for utviklingen av kronisk SCM hos NRF. Nye alternativt definerte SCM egenskaper er genetisk forskjellige fra LSCS egenskapen som brukes ved beregning av avlsverdier for NRF per i dag. De nye egenskapene vil dermed kunne bidra med mer informasjon som kan forbedre avl for bedre jurhelse. I tillegg indikerer de observerte cellulære ekspresjonsprofilene av gener involvert i migrasjon av nøytrofile granulocytter at regulering av nøytrofil vandring fremstår som en viktig del av de biologiske mekanismene bak kronisk SCM i NRF og antall av somatiske celler i melk.